单细胞测序文献精读03 | PD-1阻断后肿瘤特异性T细胞的克隆替换（视频）

Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade.

(Nat. Med. 2019 08;25(8),  IF= 30.641)

今天要给大家分享的文章是2019年发表在nature medicine上的一篇文章：PD-1阻断后肿瘤特异性T细胞的克隆替换。

（视频讲解：讲者为南方医科大学二临2017级本科生斯伃恬）

背景

首先我们来简单的看一下这篇文章的思路。

1. 阻断T细胞抑制性检查点受体的免疫疗法已改变了癌症患者的临床护理。然而，T细胞对检查点阻断的反应是依赖于已有细胞的再生还是新T细胞的募集尚不清楚。

2. 在这里，作者在抗PD-1治疗前后，对基底或鳞状细胞癌患者肿瘤的T细胞进行了单细胞RNA和T细胞受体测序。T细胞克隆分析和转录表型揭示了肿瘤识别、克隆扩增和T细胞功能抑制的特征是CD8 + CD39 + T细胞的克隆扩增，它们共同表达了慢性T细胞活化和衰竭的标志物。

3. 然而，T细胞克隆的扩增并非源于已有的肿瘤浸润T淋巴细胞。相反，扩展的克隆由以前在同一肿瘤中从未观察到的新型克隆型组成。

4. 并且，T细胞的克隆替换优先在衰竭的CD8 + T细胞中观察到，在基底或鳞状细胞癌患者中明显。

5. 这些结果表明，先前存在的肿瘤特异性T细胞可能具有有限的重振能力，并且T细胞对检查点阻断的反应可能源于新进入肿瘤微环境中的T细胞克隆。

结果

接下来我们详细的看一下本文的研究结果

1.用scRNA-seq表征PD-1阻断治疗前后基底细胞癌（BCC）TME的特点。

作者从抗PD-1治疗前后的11位晚期基底细胞癌（BCC）患者的24个位点匹配原发性肿瘤中生成了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和T细胞受体测序（TCR-seq）库（图1a，补充表1，方法）。采样的平均时间是在治疗后的54天，经过分离和排序后的细胞主要有恶性肿瘤细胞，免疫细胞和T细胞，获得这些细胞后作者进行了TIL表型与克隆动力学的综合分析。

接下来作者进行了CD3免疫组化和全外显子测序，图b是CD3免疫组化染色，显示在PD-1阻断前后，代表性BCC肿瘤中的CD3 +细胞，肿瘤边界用虚线表示。可以看出治疗后CD3 + T细胞浸润增加了。图c是基于外显子组测序的新表位负荷的治疗前后的条形图，发现在治疗前后T细胞新表位负荷出现了增高或降低的改变。

b，比例尺，100μm。每个样品进行一次免疫组织化学（n = 16个样品）。

c，如果发现该肽以小于500 allnM的结合强度与MHC等位基因结合，而其野生型同源肽以大于500 nM的结合强度与同一等位基因结合，则将变体分类为预测的新表位。

图a展示了在治疗前后样本在全外显子组测序数据中检测到的突变负荷的改变，以及根据已确定的BCC中频繁突变的基因的突变类型和碱基替换类型所占的比例。可以看出，胞嘧啶替换成胸腺嘧啶的比例最大。

图c展示的是治疗后在外显子组测序数据中检测到的T细胞克隆突变的组成变化，其中灰色表示持续突变簇，蓝色或绿色表示治疗后突变簇的细胞流行率降低，红色表示治疗后突变簇的细胞流行率升高。从左到右的图片分别表示突变负荷，治疗前后的细胞流行率和每个突变簇中预测的新表位与非同义突变的比率的条形图，在su003和su006中可以看到，红色表示的簇条形图缺失，说明治疗后出现了两个没有新表位的新型肿瘤亚克隆。

综上所述，作者发现CD3免疫组化和全外显子测序结果支持检查点阻断导致免疫反应，例如CD3 + T细胞浸润增加和治疗后突变丢失，影响克隆和亚克隆的突变以及新表位形成，这些发现提示发生了肿瘤免疫编辑。

接下来，作者从53,030个具有配对TCR序列的恶性细胞、免疫细胞和基质细胞获得了scRNA-seq图谱。图d是所有11例BCC患者治疗前后所有肿瘤驻留细胞的统一流形逼近与投影（UMAP），包括2个恶性簇、6个T细胞簇、4个基质簇、3个髓样簇、3个B细胞簇和1个自然杀伤（NK）细胞簇。图e展示了按患者身份着色的肿瘤浸润细胞的UMAP（左上），用荧光激活细胞分类仪进行的细胞分选（FACS）（右上），抗PD1治疗状态（左下）和TCR（右下）的情况。值得注意的是，来自不同患者的免疫细胞聚集在一起，表明不同患者之间相同免疫细胞类型的肿瘤微环境（TME）一致。

d.颜色表示的簇用细胞类型进行标记，包括两个恶性簇，两个CD4 + T细胞簇， 三个CD8 + T细胞簇，增殖（prolif）T细胞，内皮细胞，黑素细胞，成肌纤维细胞，癌相关成纤维细胞（CAF），树突细胞（DC），巨噬细胞，浆细胞样树突细胞（pDC），三个B细胞簇和一个NK细胞簇。

单细胞拷贝数变异（CNV）估计仅显示恶性细胞中的患者特异性拷贝数变异。最左边用不同的颜色表示8个恶性肿瘤患者的细胞，以及灰色代表非恶性肿瘤细胞，以及治疗前和治疗后两种情况。右边展示的是1-22号染色体上基因拷贝数变异的情况和基因表达量的上调/下调。最下方还标注了对应染色体上表达出现改变的基因。例如TP53位于16号染色体上，其表达出现了下调。

f，基于scRNA-seq数据推断的CNV概况。非免疫，非恶性细胞（成纤维细胞和内皮细胞，n = 2,122）被用作恶性细胞CNV推断的正常参考（n = 3,548）。

图g，不同BCC亚型染色的代表性实例，三种亚型分别是结节型，浸润型和变异型。图h是按患者和临床亚型显色的恶性细胞的UMAP。3548个恶性细胞的聚集显示出按患者和BCC亚型聚集，表现出像在其他癌症中观察到的显著的肿瘤间异质性。

g，比例尺，100μm。对每个样品进行苏木精和曙红染色一次（n = 9个样品）。h，按患者（左）和临床亚型（右）显色的恶性细胞的UMAP。

图b是患者聚集的恶性BCC细胞之间差异表达基因的热图。在所有恶性细胞和其他TME细胞之间差异表达的核心BCC基因显示在顶部簇中。患者之间差异表达的基因显示在底部簇中。与癌症相关途径相关的特定基因及其功能用不同的颜色来表示，如肿瘤核心基因用红色表示。由此，作者确定了一个恶性基因表达程序，它们是BCC的已知标记（扩展数据图3b）。作者鉴定了577个在患者肿瘤之间差异表达的基因，包括Ras信号转导基因，这提示了BCC中鳞状细胞途径的异常激活。

b，患者聚集的恶性BCC细胞（n = 3,548）之间差异表达基因（行，n = 577）的热图（列，n = 8）。将差异表达的临界值调整为P <0.01（Bonferroni校正，两尾Wilcoxon秩和检验），对数转换后的平均倍数变化> 0.3，阳性细胞分数差异> 0.3。

作者根据大量RNA测序的BCC和鳞状细胞癌（SCC）的表达特征多样性对恶性细胞进行评分，揭示了在结节性BCC中具有基质特征富集而在浸润性和异型BCC中具有鳞状特征富集（图1i）。在这幅图的下面这部分，作者用红色代表基质相关特征，蓝色代表鳞状特征相关，且颜色越深特征越明显。下方的4个基因是BCC和SCC的基因标记，是从先前发表的研究中获得的，它们的灰色越深，表示表达量更高。诊断部分还指出了与每个细胞相关的临床诊断，绿色代表结节型BCC，橙色代表浸润型BCC，红色代表异型BCC。

2.衰竭的CD8 +肿瘤浸润性T细胞克隆扩增并表达肿瘤特异性标记物。

接下来，作者重点研究肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），以了解克隆T细胞对检查点阻断的反应。首先，作者重新聚集了33,106个TIL，并鉴定出9个不同的T细胞簇，其中包含来自多个患者以及取自治疗前后多个时间点的细胞（方法，图2a，b，扩展数据图4a-d）。

这幅图是每个T细胞簇的大量T细胞亚型特征的富集。红色代表该类细胞在对应T细胞簇中的高度富集。可以发现，CD4 +簇包括Treg）、卵泡辅助性T（TFH）细胞和TH17）。CD8 +簇包括幼稚细胞、记忆细胞、效应记忆细胞、活化细胞、长期活化/衰竭细胞（以下称为衰竭细胞）和中期衰竭/活化细胞，它们共同表达与激活和衰竭相关的基因。

a，T细胞亚型特征来自大量数据集（来自本研究和先前发表的研究），BCC数据集中的单个T细胞获得了特征富集。热图代表每个簇的z评分平均特征富集。

图a是PD-1阻断前后的BCC样品中存在的肿瘤浸润性T细胞的UMAP。在左图中，对应细胞簇用标记有推断细胞类型的颜色表示。UMAP还按患者和抗PD-1治疗状态着色。图b是属于不同T细胞亚群的细胞之间差异表达基因的热图。右侧突出显示了与不同的T细胞簇相关的特定基因，基因的颜色与a图的T细胞簇相对应。热图顶部的条形图指示每个簇中的细胞数，治疗后富集和患者数。值得注意的是，作者观察到治疗后激活、衰竭和衰竭/激活的CD8 + T细胞的频率增加，支持PD-1阻滞主要影响CD8 + T细胞的结论。

b，属于不同T细胞亚群（列）的细胞之间差异表达基因（行）的热图。

作者使用扩散图来使伪时间中的CD8 + T细胞簇与有序细胞之间的关系可视（方法，图2c）。第一个扩散成分将活化和衰竭细胞分离，并与T细胞衰竭基因（包括PDCD1和HAVCR2）高度相关；而第二个扩散成分将天然和记忆细胞与活化和衰竭细胞分离，并与T细胞活化基因高度相关，包括IFNG和TNF（图2c，扩展数据图5a，b）。

c，使用前两个扩散成分（左侧）的原始，记忆，活化和衰竭的CD8 + T细胞的扩散图。像a中一样，基于群集标识对单元进行着色。弥散伪时间和治疗状态（右上图）也会使细胞着色。选定的核心激活和衰竭基因的平均表达沿扩散成分1和2（右下）定量。

在附图a和b中，作者展示了分离细胞和筛选基因的过程。图a是扩散簇1和2中的簇坐标（左，中）分离的细胞坐标的小提琴图以及伪时间值的小提琴图。可以看出，在DC1上可以分离活化和衰竭细胞，DC2上可以分离天然细胞记忆细胞和活化衰竭细胞。图b是属于每个细胞类型簇（列）的细胞中扩散成分1和2（行）具有最高相关性的基因表达的热图。作者在热图中筛选出的表达显著上调的基因就与DC1和2分离的细胞相关。

图d是活化，衰竭和活化/衰竭的CD8 + T细胞（n ＝ 5,454细胞）之间差异表达基因的共表达分析。最左边的一列将基因分为活化，活化/衰竭，衰竭三类，分别用蓝色，橙色和红色表示。插图显示了通过层次聚类确定的核心衰竭模块，并突出显示了典型衰竭基因。作者使用共表达分析在检查点阻断的情况下确定了核心T细胞衰竭特征，其中包括已知的衰竭标志（HAVCR2，TIGIT）、组织驻留记忆T细胞（TRM）标志物（ITGAE，CXCR6）和具有肿瘤反应性的CD8 +浸润T细胞的标志物，其中包括CD39（由ENTPD1编码）（图2d）。这些结果表明衰竭CD8 + TILs在PD-1阻断后会增加并表达慢性激活、T细胞功能障碍和肿瘤反应性的基因特征。

随着肿瘤抗原特异性CD8 + T细胞在生产免疫应答过程中克隆扩增，作者分析了单细胞TCR序列以鉴定克隆扩增细胞的肿瘤特异性指标。作者按TRA（编码TCRα）和TRB（编码TCRβ）序列对细胞进行了分组，并注意到与其他CD8 +簇相比，衰竭T细胞克隆体积较大（图2e）。作者使用基尼系数（Gini index）测量了克隆性，发现与所有其他CD8 + T细胞相比，衰竭T细胞的克隆性明显更高（图2e）。

e，由克隆大小着色的CD8 + T细胞亚群的扩散图（左）和为每个患者计算的每个CD8 + T细胞簇的基尼指数的箱形图（右），显示了衰竭的CD8 + T细胞内的显着克隆扩增（n = 相对于基本均值的单尾不配对学生t检验；对于所有箱线图：箱中心线，中位数；箱极限，上下四分位数；箱须，1.58×四分位数间距）。衰竭指的是衰竭簇和衰竭/活化簇。

为了检查克隆扩增与衰竭之间的联系，作者分别基于与IFNG和HAVCR2表达相关的前50个基因对所有CD8 +细胞的活化和衰竭信号进行了评分（图2f）。作者发现具有极度衰竭特征的T细胞表现出与肿瘤反应性相关的基因表达模式，包括CD39（由ENTPD1编码）和CD103（由ITGAE编码）表达。

f，所有CD8 + T细胞（n = 17,561）的活化分数（基于与IFNG表达最相关的前50个基因的表达）与衰竭评分（基于与HAVCR2表达最相关的前50个基因的表达），由表达水平进行着色表示。

为了表征单个克隆，作者对克隆中所有细胞的衰竭和激活得分取平均值，并用颜色将T细胞进行分类，其中衰竭型用红色或橙色表示。圈的大小分表表示克隆的大小或细胞周期得分。可以发现最大的克隆中观察到高衰竭基因特征，衰竭克隆也表现出高增殖特征。

g，根据属于该克隆的单个细胞的平均激活和衰竭分数，用属于该克隆的细胞最频繁分配的表型进行着色，对具有一个以上细胞（n = 4222）的TCR克隆进行激活得分与衰竭得分富集，圈的大小取决于克隆大小（右上）或细胞周期得分（右下）。

3.肿瘤浸润性T细胞的克隆动力学和表型转变

接下来，作者分析了T细胞表型和克隆型之间的谱系关系。

a，左侧是由选定的TCR克隆着色的肿瘤浸润T细胞的UMAP（左）。右侧由属于相同TCR特异性（GLIPH）组的TRB克隆着色的T细胞的UMAP（右）。由此可以看出不同T细胞克隆对应的细胞表型。b，上面和中间的图显示了属于相同TCR克隆或TCR特异性组TRB克隆的单个细胞的表型。每个条通过克隆内单个细胞的单个表型着色。底部图显示了TCR特异性组内不同TRB克隆的表型。两项分析均显示属于相同克隆或特异性组的单个细胞之间存在明显的表型相似性。

c，左图，与来自同一样品的随机选择和大小匹配的T细胞组相比，属于同一TCR克隆或同一TCR特异性组（≥3个细胞）中每个克隆或TRB克隆中的细胞比例分布。右图，与来自同一样本的随机选择和大小匹配的T细胞组相比，属于同一TCR克隆或同一TCR特异性组但具有不同克隆型的细胞之间的细胞间相关性分布。使用差异表达基因的对数转换表达来计算细胞间的相关性。

在全球范围内，作者发现按克隆型分组的细胞比随机分组的细胞更可能具有共同的表型，并且在基因表达上的相关性更高（图3a-c）。这些结果表明，克隆扩增的TIL与细胞表型高度相关，并且PD-1阻滞不促进克隆内的表型不稳定性。

接下来，作者研究了克隆内的不同表型是否可以指导T细胞表型之间的谱系过渡。作者汇总了一个特定簇中的所有克隆型（主要表型），并测量了它与另一个簇的共享克隆型分数（次要表型）（图3d）。热图中方块的颜色越浅，说明共享的克隆表型百分比越高，表型存在重叠。广泛地讲，作者注意到CD8 + T细胞表型之间存在明显的重叠，包括记忆和活化的T细胞，这表明活化状态之间存在常见的过渡。作者检测到衰竭和效应细胞之间共同的最小克隆型，这说明这些表型之间有严格区分。CD4 + T细胞克隆在很大程度上局限于单一表型，这表明CD4 +细胞各状态之间的可塑性有限。

d，热图显示属于主要表型簇（行）的克隆型与其他第二表型簇（列）共享的克隆型的比例。

作者还观察到特异性组内单个克隆表型的非随机分布，这表明特定的T细胞表型可能是由于不同的TCR信号强度阈值引起的（扩展数据图6e）。作者注意到特异性组内CD8 +和CD4 +表型之间存在重叠，例如包含衰竭CD8 +和CD4 + Treg和TFH克隆的特异性组，这表明对同一抗原有反应的CD4 +和CD8 + TIL可能来自不同的克隆型。

e，特定主要表型（行）的克隆，同时包含属于第二表型（列）的克隆的TCR特异性比例的热图。

为了追踪PD-1阻断后的克隆细胞存亡，作者基于TRB序列在治疗时间点之间匹配克隆型，并比较每个相应克隆在每个时间点的主要表型（图3e）。作者观察到CD4 +簇之间的稳定性以及CD8 +簇之间的频繁转换。尽管作者观察到记忆和效应细胞之间频繁转换到激活状态，但治疗后衰竭的克隆并没有转变为未衰竭的表型，表明衰竭的TILs在PD-1阻断后具有有限的表型转变能力。

e，对于每个时间点至少有三个细胞的克隆，在PD-1阻滞过程中，匹配克隆的所有观察到的表型转变的热图。

先前的研究已经确定了表达转录因子TCF7的干细胞样T细胞，在PD-1阻断后可增殖。为了调查作者的数据集中是否存在相似的细胞，作者对CD8 +细胞的衰竭或TCF7 +干细胞特征进行了评分（图3f）。图f，左侧，所有CD8 + T细胞的干细胞特征评分与衰竭评分（通过指定基因的表达进行着色），用TCF基因表达量代表活化分数，用HAVCR2基因表达量代表衰竭分数。右上角是属于记忆和衰竭克隆群的细胞的干细胞特征评分与衰竭得分（按表型着色）。右下角是干细胞特征评分的小提琴图，用于区别记忆和衰竭的克隆治疗后丰度的变化。作者观察到少量细胞28％的衰竭细胞具有高表达的TCF7 +和衰竭信号。并且对于记忆表型和衰竭表型，治疗前持久性克隆与收缩型克隆相比明显具有更高的TCF7 +干细胞特征（图3f）。

但是，该分析仅限于两个明显扩增的衰竭克隆，作者鉴定出10个衰竭克隆，这些克隆在治疗后的频率，也就是（用圆圈大小表示的）细胞的数目有所增加，但先前由于克隆尺寸小和扩增受限而被排除在外（图3g）。尽管具有高TCF7 +信号预处理能力的那些克隆扩展更为明显，但这些克隆中的大多数仍处于衰竭状态。

但是，由图h可看出，只有一小部分（10.3％）的治疗后衰竭克隆来自包含TCF7 +细胞的克隆，这表明治疗后衰竭克隆可能源自其他来源（图3h）。

h，治疗后具有衰竭表型的所有克隆的饼状图，通过克隆在治疗前是否包含具有高TCF7表达的细胞进行着色。

4.PD-1阻断后衰竭CD8 + T细胞的克隆替代

由于治疗后极少数已有的衰竭T细胞表现出扩增，作者通过比较每个克隆的治疗前后频率来研究治疗后克隆的整体丰度如何变化（图4a）。图a的散点图比较了通过scRNA-seq和scTCR-seq测量的所有BCC患者（n = 11患者）治疗前后的TRB克隆频率。左侧突出显示了在治疗后明显扩增或收缩的克隆（用三角形的方向和颜色区分）。作者鉴定出治疗后显著扩增的克隆，其中在68％的显著扩增的克隆中有许多在治疗前未检测到的新克隆。中间和右侧的图突出显示了大多数细胞表现出衰竭表型（红色）或记忆表型（右侧，蓝色）的克隆，可以看到衰竭T细胞在治疗后频率是增高的，并且有部分是扩增的。

scRNA序列数据的整合揭示了每种表型的持久模式截然不同。即，治疗后的衰竭克隆显著富集了新的克隆型，平均每位患者有84％的衰竭克隆来自新的克隆型，而只有40％的幼稚、活化、记忆或效应细胞是记忆克隆（图4a，b）。

b，治疗后每个簇中通过scRNA-seq和scTCR-seq检测到的新克隆的比例的箱形图（n =患者数）。

图c是基于scRNA-seq和scTCR-seq的TRB克隆频率的Lorenz曲线，在治疗前通过每个克隆的存在着色。新克隆在每个表型中的比例在右边被量化。在所有患者中，治疗后衰竭克隆的55％来自新克隆型，而记忆克隆为20％（图4c）。

接下来作者思考新克隆的扩增（作者称之为克隆替代）是如何影响每位患者的衰竭T细胞频率的。作者发现11名患者中有7名在治疗后CD8 + T细胞的衰竭细胞频率增加，而7名患者中有6名来自新型克隆型（图4d）。

d，通过scRNA-seq和scTCR-seq为每位患者检测到的总T细胞中的衰竭细胞比例，按治疗状态分开。高亮显示属于后处理中检测到的新克隆的细胞。

有趣的是，治疗后的衰竭克隆富含新的TCR特异性组，这表明新的克隆可能代表了新的抗原特异性（扩展数据图8b）。

b，治疗后的TCR特异性组中每个簇中新的TCR特异性组的分数的箱形图。

为了提高检测稀有克隆型的灵敏度，作者对从11位患者中的8位患者的样本中获得的剩余活检材料进行了大量TCR测序（图4e）。类似于单细胞TCR测序分析，作者观察到大量新的扩增克隆，也就是图中尖朝上的三角形，它们要么在治疗前未扩增（<5个细胞），要么在治疗前未检测到。

e，散点图比较通过批量TCR-seq测量的治疗前和治疗后TRB克隆频率（n = 8位患者）。左侧突出显示了基于二项式检验而显着扩增或收缩的克隆（双面，经Bonferroni校正，P <0.01）的克隆，扩增的克隆根据其检测预处理进一步分离。突出显示了大多数细胞基于scRNA-seq（中间，红色）衰竭CD8 +表型或记忆CD8 +表型（右侧，蓝色）的克隆。

除此之外，作者发现与所有其他CD8 +表型相比，衰竭细胞在治疗后具有显着扩大的克隆比例，并且大部分的扩增克隆都来自新的克隆型，这在治疗后在所有衰竭扩增细胞患者中均能观察到（图4f，扩展数据图8c）。

f，基于总体TCR-seq的，具有显着扩增后处理的克隆级分的条形图，其通过表型分离并通过置换状态着色。

为了说明这是否由于采样偏差造成，作者对一名患者相应部位的样本在治疗前两次和治疗后两次以大约两个月的间隔进行了批量TCR测序（扩展数据图8d）。作者在5月2日和7月14日分别进行了两次治疗前的采样，患者在7月19日接受第一次PD1阻滞治疗，在10月10日和12月12日进行治疗后的两次采样。当比较治疗前后的样本时，也就是左下角的图，治疗后出现的新克隆以深红色突出显示，并且仅在治疗前和治疗后的比较中被检测到，而在治疗前时间点的比较中未检测到，这表明替换主要是由于PD-1阻滞而不是采样之间的时间。因此作者仅观察到了衰竭克隆的克隆替换，这表明衰竭细胞的TCR动态主要受PD-1阻滞的影响，而不是肿瘤活检的时机或位置。

d，散点图比较通过TCR-seq测量的时间点之间的TRB克隆频率与患者su001中的连续时间点；突出显示了大多数细胞共享疲惫的CD8 +表型（红色）或记忆CD8 +表型（蓝色）的克隆。

为了确定是否可以在外周血中检测到新的克隆扩增的TIL，作者对5名患者的10个血液样本进行了大量TCR测序。总体上，在血液中也可以检测到41％的TRB克隆型，但它们仅代表6％的血液克隆型多样性（图4g）。在治疗后的外周血中检测到35.5％的新型衰竭肿瘤浸润T细胞克隆型，尤其是在治疗前外周血中检测到了11.8％的新型衰竭克隆型（图4g）。

g，通过大量TCR-seq检测到的外周血TRB克隆与肿瘤浸润性T细胞重叠（n = n5患者，左）。在外周血中检测到的TIL克隆的分数，由样品分离（右上）。在外周血单核细胞（PBMC）中检测到的新型衰竭TIL克隆的分数，按治疗状态分开（右下）。

通过比较肿瘤和外周血的T细胞克隆型频率，作者比较了克隆型在肿瘤和外周血中的富集。作者注意到相对于治疗后的其他表型，衰竭克隆在肿瘤中的富集度显著增加，表明它们在肿瘤中存在优先的扩增，支持了这些克隆是肿瘤特异性的观点（图4h）。这些结果表明，监测血液中针对检查点阻断的克隆性肿瘤特异性T细胞反应可能是可行的，并且可能会从外周来源募集新的TIL克隆。

h，通过批量TCR-seq检测到的克隆富集（肿瘤频率/ PBMC频率）的小提琴图，通过表型和治疗状态进行了分离。

最后，作者思考在不同的癌症类型中是否可以观察到衰竭细胞的克隆替代。作者生成了鳞状细胞癌的scRNA测序和scTCR测序图谱，这些图谱是从接受抗PD-1治疗的4例SCC患者的肿瘤活检中获得的，在治疗后平均31天获得SCC样本。

在图j中，作者观察到，治疗后检测到的衰竭细胞中相当一部分来自新型克隆型（图4j）。而且从图k中看出，相比于其他CD8+克隆的29％的扩增，扩增的衰竭克隆50％来自新克隆型（图4k）。

总结

最后我们简单的总结一下这篇文章

1. 本文作者进行了单细胞分析，表明克隆扩增的细胞高度富含衰竭CD8 + T细胞，并表达了肿瘤特异性标记物，包括CD39和CD103，与其他表型相比，治疗后衰竭CD8 + T细胞的克隆库在很大程度上被新型克隆所取代。这些结果表明，T细胞对免疫疗法的反应源自肿瘤特异性T细胞克隆的独特组成。

2. 但是，作者的研究没有发现新型T细胞克隆的来源，新克隆可能来自肿瘤外源性来源，比如淋巴器官，或者来源于肿瘤周围罕见的未扩增克隆，因此需要进一步的工作来鉴定新型T细胞克隆的来源及其对临床反应的影响。

3. 此外，PD-1阻断后新型TCR克隆和特异性基团的扩增，表明新型T细胞克隆可能引发独特的免疫编辑波。免疫编辑波识别的抗原可以使用高通量肿瘤特异性检测进一步研究。

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