蛋白质组学研究的三大支撑技术 | 蛋白专题
蛋白质组学研究有三大支撑技术：分离技术、鉴定技术、分析技术
自1994年Williams和Wilkins首次提出蛋白质组概念、1996年澳大利亚建立第一个蛋白质组研究中心以来，经过20多年的发展，蛋白质组学研究技术不断完善。时至今日，蛋白质组学研究已经形成了商业化的、普遍应用的技术手段。
蛋白质组学的研究，根据分离技术的不同可分为基于凝胶分离的蛋白质组学研究路线和基于色谱分离的蛋白质组学研究路线。
二维凝胶电泳（2-DE）技术拥有超强的分辨能力，能够同时将数千种蛋白同时分离展示，而且它包括了许多蛋白质不同修饰形态的信息。2-DE是根据蛋白质等电点（pI）和分子量（MW）的不同，将混合蛋白质通过等电聚焦（IEF）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）在两个水平上进行分离，最后使众多蛋白能在等电点和分子量两个方向分开。2-DE的分辨率和灵敏度都很高，一般可分离1000至3000个蛋白质，最高可分辨达11000个蛋白质，因此目前被认为是最好的蛋白质分离技术。但是2-DE的样品制备难度很大，如若样品制备不成功，会导致多数二维凝胶结果无法使用，也就无法进行后续的定性、定量分析。所以2-DE实验对操作者的实验技能水平要求极高，让科研人员是又爱又恨。
2-DE的图像采集分析系统可以记录不同蛋白质斑点的位置、大小、染色深浅、pI和分子量大小。通过不同图谱间的比较，差异的蛋白质斑点被确定。将差异蛋白切割下来后酶解消化的到短片段的多肽，进一步的质谱分析可以得到肽段的氨基酸组成，进而确定具体蛋白质。
双向荧光差异凝胶电泳（DIGE）是在传统双向电泳的基础上发展而来的新型蛋白质组学定量技术，其分离蛋白的基本过程与传统双向电泳一致。但DIGE使用三种荧光染料（Cy2、Cy3和Cy5）标记不同组别的蛋白，并在同一张凝胶上对标记好的三组蛋白混合物进行电泳分离，是一种多通道分离技术。通常情况下，Cy3和Cy5分别标记两组蛋白；Cy2标记所有组别蛋白的混合物，作为内参使用。电泳分离后，在激光扫描仪中分别用相应波长的激光进行扫描，即可在同一张凝胶中得到三组蛋白的图谱。凝胶扫描后，用专用的Typhoon软件进行分析对比得到准确可靠的定量信息。
相对而言，基于色谱分离的蛋白质组学技术在操作上就要简单的多，可操作性也更强。目前蛋白质组学技术服务商提供的项目也基本上采用此策略。
色谱分离是使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。处于柱起始端的样品中各组份在固定相与流动相之间重新分配并随流动相流出。与流动相作用弱的组份随流动相流出的速度慢，而与流动相作用强的组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差异，使得混合组份被分离，在不同的时间点流出，因而可以对不同组份物质分别进行定性、定量分析。
基于色谱分离的蛋白质组学研究策略的蛋白定量、定性均采用质谱分析结果。蛋白混合物被酶解为短片段后进行色谱分离。质谱仪与液相色谱串联，分离肽段直接进入质谱仪并被离子化，一级质谱测定肽质量，检索得到相对分子质量的几个肽段。二级质谱得到碎裂的肽段离子信息，综合两者信息得到具体的肽段序列。定量信息则来自肽段质谱峰强度的积分面积。
蛋白质鉴定需要有对应的蛋白质组文库，质谱鉴定数据与文库蛋白模拟酶解片段比对得到肽段序列，再进一步比对蛋白得到鉴定蛋白结果（质谱鉴定原理、肽段、蛋白鉴定将在下一期介绍）。所以，模式物种或其它数据库收录较全的物种蛋白鉴定可以直接从数据库下载相应蛋白序列。而数据库没有收录的非模式物种则需要同时做无参转录组项目，然后进行蛋白的检测和分析。
LC-MS/MS流程图
蛋白质组学的分析主要指蛋白的生信分析，依赖于数据库的建立。现在常用的蛋白质组学生信分析有GO功能分析和KEGG通路分析。GO（gene ontology）是基因本体联合会（Gene Onotology Consortium）所建立的数据库。根据基因产物的相关分子功能、生物学途径、细胞组分而给予定义，无物种相关性。KEGG（Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组百科全书）是系统分析基因功能，它将基因组的信息与基因功能联系起来，旨在揭示生命现象的遗传与化学蓝图。旨在借助计算机全面地展示细胞和生物所包含的生物学信息；根据基因组中的信息，用计算机计算或者预测出比较复杂的细胞中的通路或者生物的复杂行为。
GO KEGG富集分析散点图
KEGG通路图
近年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便、有效的计算机分析软件，随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将推动新技术、新方法的发展。特别是蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学领域的交叉，所呈现出的系统生物学研究模式，将成为未来来生命科学新前沿。