又一外泌体lncRNA被发现与乳腺癌的曲妥珠单抗耐药有关！

乳腺癌已成为全球癌症相关死亡的主要原因，也是女性最常见的癌症。大约20%的乳腺癌患者HER-2过表达，因此预后较差。目前，靶向HER-2胞外区域的人源化单克隆抗体曲妥珠单抗已是HER-2阳性乳腺癌的替代治疗方案。然而，只有一小部分转移性患者对曲妥珠单抗有反应，大约60%的患者在最初反应后产生耐药性。

外泌体是一种释放到组织液中且大小为20-150nm的具膜小泡，小泡中含有来自供体细胞的蛋白质、脂质、编码和非编码RNAs，这些分子可以被其他细胞所摄取。有文献报道，有些lncRNAs在乳腺癌曲妥珠单抗耐药过程中起重要作用。然而，外泌体包裹的lncRNAs是否参与了耐药作用尚不清楚，需要进一步研究。

近日，海南省人民医院和郑州大学附属第一医院共同在《Molecular Cancer》上发表论文，阐述了外泌体lncRNA（AFAP1-AS1）可以与AUF1结合，促进ERBB2翻译，从而诱导曲妥珠单抗耐药。

实验结果

1.LncRNA AFAP1-AS1在曲妥珠单抗细胞中上调并被H3K27ac激活

作者首先建立了乳腺癌的曲妥珠单抗耐药株（SKBR-3-TR和BT474-TR），再将SKBR-3-TR和SKBR-3亲本细胞进行高通量测序，根据火山图、表达倍数变化等生物信息学分析发现AFAP1-AS1在这两种类型细胞中显著失调。随后，作者用qRT-PCR验证了AFAP1-AS1在乳腺癌耐药细胞系中的水平，结果显示，与亲本细胞相比，耐药细胞系中的AFAP1-AS1水平显著上调。同时，HER-2阳性乳腺癌组织中AFAP1-AS1水平比HER-2阴性乳腺癌组织也明显升高。

随后作者通过表观遗传修饰实验发现在AFAP1-AS1启动子区域大量富集组氨酸乙酰化（H3K27ac）。此外，曲妥珠单抗处理显著增加了亲代乳腺癌细胞H3k27ac的富集水平。总之，AFAP1-AS1在曲妥珠单抗细胞中呈现上调，主要是因为在AFAP1-AS1启动子区域H3K27ac富集增加（Fig. 1）。

Fig. 1 LncRNA AFAP1-AS1在曲妥珠单抗细胞中上调并被H3K27ac激活

2.干扰lncRNA AFAP1-AS1可以逆转曲妥珠单抗的耐药性

作者对AFAP1-AS1进行干扰后，通过CCK8实验发现AFAP1-AS1敲低会显著增加曲妥珠单抗对细胞活力的抑制作用。此外，EdU染色和Transwell迁移实验表明了敲低AFAP1-AS1也明显降低了细胞增殖和减少细胞活力。

随后作者进一步考察了AFAP1-AS1过表达对SKBR-3和BT474亲本细胞曲妥珠单抗的耐药性影响。实验表明，提高AFAP1-AS1可以消除曲妥珠单抗处理引起的细胞死亡，此外，AFAP1-AS1过表达可以促进细胞的增殖和迁移能力（Fig. 2）。

Fig. 2 AFAP1-AS1敲低能逆转乳腺癌细胞的曲妥珠单抗耐药性

3.LncRNA AFAP1-AS1水平与HER-2阳性乳腺癌患者的曲妥珠单抗耐药性相关

作者用qRT-PCR检测了64个HER-2阳性患者组织样本的AFAP1-AS1表达水平，其中有32例曲妥珠单抗耐药患者和32例曲妥珠单抗反应患者。结果表明，曲妥珠单抗耐药患者中AFAP1-AS1水平比敏感患者显著上调。作者发现，无反应患者血清中的AFAP1-AS1水平比有反应患者的明显提高。此外，Kaplan-Meier分析显示，曲妥珠单抗治疗的乳腺癌患者在接受治疗前，其血清内具有高水平AFAP1-AS1，且与PFS和OS降低相关（Fig. 3）。 

Fig. 3 高水平AFAP1-AS1与接受曲妥珠单抗治疗的乳腺癌患者的不良反应有关

4.胞外AFAP1-AS1通过装入外泌体中进行传递

作者用AFAP1-AS1探针进行FISH实验，结果显示，AFAP1-AS1主要分布在曲妥珠单抗耐药细胞的细胞质中，这意味着AFAP1-AS1可能被包裹外泌体中进行分泌。接着，作者用RNAse和Triton×100处理细胞培养上清，发现AFAP1-AS1释放时用膜包裹而不是直接释放。随后，作者分离细胞培养上清中的外泌体，通过TEM、NTA和WB实验进行鉴定，表明分离出的外泌体具有典型的膜状结构、直径大小在30-150nm，且蛋白TSG101和CD81在外泌体中的大量富集。此外，通过对细胞培养上清和外泌体中的AFAP1-AS1进行检测，发现外泌体是胞外AFAP1-AS1分泌的主要载体。同时，作者观察到曲妥珠单抗耐药细胞的培养上清中AFAP1-AS1水平明显比敏感细胞高。

为了了解AFAP1-AS1如何包裹到外泌体中，作者通过RIP实验发现了AFAP1-AS1与HNRNPA2B之间相互作用。再将HNRNPA2B进行干扰或过表达后，AFAP1-AS1水平分别呈现降低或增高。这些结果表明AFAP1-AS1以一种依赖HNRNPA2B1的方式被特异性包裹入外泌体(Fig. 4)。

Fig. 4 胞外AFAP1-AS1通过包裹入外泌体进行传递

5.外泌体介导的AFAP1-AS1传递可传播曲妥珠单抗耐药

作者从SKBR-3-TR细胞上清中分离外泌体，并用PKH26染料进行标记，再与SKBR-3和BT474共孵育48h，结果显示，受体细胞有强烈的红色信号，表明受体细胞能很好地吞噬外泌体。随后，提取受体细胞质中的RNA用qRT-PCR检测，作者发现与外泌体共孵育后，受体细胞中的AFAP1-AS1水平显著升高，这说明了外泌体中的AFAP1-AS1能够传递到受体细胞中。

作者进一步研究了外泌体递送的AFAP1-AS1是否能同时将耐药表型传递给受体细胞。实验结果显示，用SKBR-3-TR来源的外泌体孵育的亲本细胞对曲妥珠单抗的敏感性降低。再用外泌体分泌抑制剂GW4869处理SKBR-3-TR细胞，用处理后的SKBR-3-TR上清与亲本细胞共孵育，发现上清没有将曲妥珠单抗耐药性传递给受体细胞。同时，敲低AFAP1-AS1和HNRNPA2B1能抑制共培养的亲本细胞获得曲妥珠单抗耐药的能力（Fig. 5）。 

Fig. 5 外泌体介导的lncRNA AFAP1-AS1转移能诱导曲妥珠单抗耐药性

6.AFAP1-AS1通过上调HER-2表达诱导曲妥珠单抗耐药性

作者通过免疫荧光检测发现与亲本细胞相比，HER-2蛋白在SKBR-3-TR和BT474-TR细胞中是上调的。在曲妥珠单抗耐药细胞中，敲低AFAP1-AS1能降低HER-2表达，但是用qRT-PCR检测ERBB2（ERBB2用于指示HER-2蛋白的编码RNA）表达时，发现AFAP1-AS1对ERBB2水平影响不显著。此外，过表达AFAP1-AS1能上调HER-2蛋白水平而ERBB2水平不受影响。总之，作者证实了AFAP1-AS1在曲妥珠单抗耐药和HER-2表达上调中的作用，然而，AFAP1-AS1/HER-2信号轴是否参与了曲妥珠单抗耐药还有待进一步证实（Fig. 6）。

Fig. 6 乳腺癌细胞中lncRNA AFAP1-AS1能调节HER-2蛋白水平

7.LncRNA AFAP1-AS1与AUF1结合发挥关键作用

作者通过RNA-FISH和细胞分级PCR可以分析出，AFAP1-AS1主要分布在曲妥珠单抗耐药细胞的细胞质中，这揭示了AFAP1-AS1可能在转录后水平调节下游信号通路。作者通过最小自由能（MFE）评估，发现在911-1190nt位点的AFAP1-AS1转录本形成茎环结构，这对于靶向RNA结合蛋白的结合至关重要。随后，通过RNA pulldown实验作者鉴定出了AUF1蛋白，它能够结合到目标mRNA的3’非翻译区（UTR）并促进其翻译而不影响mRNA水平。免疫荧光检测出AUF1和AFAP1-AS1在细胞质中共表达。通过AFAP1-AS1探针设计和RNA pull-down实验，作者发现AUF1蛋白被AFAP1-AS1大量富集。此外，RIP实验验证了AFAP1-AS1可由AUF1沉淀下来。AUF1在转录和蛋白水平上均不受AFAP1-AS1敲低的影响。这些结果表明了AFAP1-AS1能与AUF1蛋白结合，发挥重要的生物功能（Fig. 7）。

Fig. 7 AFAP1-AS1与AUF1相互作用，从而激活了ERBB2的翻译

8.敲低AFAP1-AS1可以逆转曲妥珠单抗耐药和体内转移

作者先将SKBR-3-TR和BT474-TR细胞感染了sh-AFAP1-AS1或sh-NC，构建了干扰的稳定株，再将稳定株皮下注射入裸鼠中，形成干扰的动物模型，随后进行曲妥珠单抗腹腔治疗。将20天后裸鼠中的肿瘤剥离并分成不同组，结果显示，sh-AFAP1-AS1组形成的肿瘤明显比对照组小。通过IHC检测发现由sh-AFAP1-AS1感染细胞形成的肿瘤，其HER-2表达水平低于由对照组形成的肿瘤。

作者将感染了sh-AFAP1-AS1的SKBR-3-TR稳定株通过尾静脉注射入裸鼠中，结果发现，由sh-AFAP1-AS1稳定株产生的萤光素酶计量和肺转移灶数明显少于由sh-NC细胞形成的肺转移灶数。与正常肺组织相比，HE染色肺组织转移灶阳性区域明显改善。总之，作者验证了干扰AFAP1-AS1后可逆转妥珠单抗耐药性和乳腺癌的体内转移（Fig. 8）。

Fig. 8 敲低AFAP1-AS1能在体内逆转曲妥珠单抗耐药

结论

作者从曲妥珠单抗耐药株用lncRNA芯片筛选出高表达的lncRNA AFAP1-AS1，再通过功能获得和缺失实验揭示了敲低AFAP1-AS1能逆转曲妥珠单抗耐药性。此外，细胞外的AFAP1-AS1能与外泌体结合，传递曲妥珠单抗耐药性。机制上，AFAP1-AS1通过与AUF1结合提高ERBB2 mRNA的翻译，从而诱导HER-2蛋白水平的上调，进而引起曲妥珠单抗耐药性（Fig. 9）。

Fig. 9 曲妥珠单抗耐药传递的机制

参考文献：

Mol Cancer. 2020; 19: 26. Exosome-mediated lncRNA AFAP1 AS1 promotes trastuzumab resistance through binding with AUF1 and activating ERBB2 translation.

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