从2018年开始到2020年4月，总计有超过160篇关于m6A的研究所投杂志影响因子超过10分。那么这些高分文章中究竟必定有一些共同之处。
无论是植物还是动物，目前的研究都已经开始从最初的m6A甲基化图谱类文章，深入到一些具体的机制研究中。要研究透彻一种机制，仅仅做一个m6A测序是不够的。做完了测序，后续的研究工作才是真正的开始。
已知m6A甲基化一共有三类酶参与其中。Writers即甲基化转移酶能够催化腺嘌呤A促进m6A修饰。Erasers即去甲基化酶能够使发生m6A修饰的腺嘌呤重新变为未修饰的A碱基。Readers即甲基化阅读蛋白虽然不参与动态可逆的m6A修饰过程，但是能够识别带有修饰m6A的RNA后，继续行使下游功能如促进翻译、RNA剪切加工、出核转运、RNA降解以及维持RNA稳定性等。
如何继续深究这些下游的功能，是几乎所有m6A研究中都会涉及到的一环，尤其是阅读蛋白发挥着十分重要的作用。寻找阅读蛋白结合到具体的某个靶基因，能够将一项工作往更深入的方向挖掘。
那么怎么样才能够研究这些被阅读蛋白结合的RNA呢？答案就是我们的RIP-seq。
我们先来简单看下RIP的定义，以及RIP-seq究竟能干嘛？
RIP是一种基于抗体的技术，用于定位体内的RNA-蛋白质相互作用。将所关注的RNA结合蛋白(RBP)与其结合的RNA一起进行免疫沉淀，通过PCR、芯片或高通量测序的方法，来鉴定结合转录RNA如mRNA、lncRNA、circRNA等。所以说近几年，随着表观遗传学和RNA生物学领域对不同RNA作用和功能的关注大大增加，RNA的功能远不止转录和后续的翻译。例如，RNA-蛋白质相互作用能够调控mRNA和非编码RNA的功能。如何对这些RNA潜能有新的认知，将进一步推动相关技术发展如RNA pulldown和RIP-seq等，使得研究人员能够定位RNA-蛋白质相互作用。所以说，RIP与高通量测序技术相结合后的RIP-seq，是一种研究单个蛋白质结合所有RNA分子互作的不二之选，通量远远高于RIP-qPCR。2RIP-seq究竟选择内源性IP还是外源性IP？通常我们会看到高分文章里的RIP-seq既有内源性IP，也有外源性IP。关于这个话题今后我们会专门开设一个专栏进行讲解。今天仅仅是简单做一个说明。通常内源性IP，需要满足一些必要条件——① 有IP级别的抗体；② 蛋白起始量要够大。如果仅仅是跑WB那些抗体，有些并不能真正用于后期的RIP-seq，必须是IP级别的抗体才行。而一些丰度较低的蛋白，后期准备细胞或组织的时候一定要加大样本量。我们根据WB条带结果，可以将细胞量提升好几倍。早期的RIP-seq，细胞量甚至可以达到10的9次方。不过现在绝大部分RIP-seq所需的细胞量不足10的8次方。而外源性IP的原因就比较复杂了。有些研究仅仅是为了证明，某个RNA结合蛋白与自己感兴趣的靶RNA互作，例如通过FLAG抗体与FLAG-YTHDC1融合蛋白进行CO-IP后，对RNA进行洗脱后发现YTHDC1能够结合ZCCH8这个mRNA。有些则是这类蛋白确实没有商业化的IP级抗体出售，而自己实验室却无法制备高质量的抗体，退而求其次使用外源性FLAG抗体。有些则正好细胞中某个RNA结合蛋白过表达后表型非常明显，一箭双雕。下面我们就来看看这些高分文章中，作者是如何运用RIP-seq进一步推动m6A下游更深层次的分子机制研究3 RIP-seq在植物和医学中m6A研究的典型案例3.1. IGF2BP家族蛋白调控MYC等RNA的稳定性主要的生化手段：外源性FLAG-RIP LC-MS/MS、内源性IGF2BP-RIP-seq、RNA pulldown期刊及影响因子：Nature Cell Biology (IF=17.72) 2018, 20(3):285-295陈建军课题组在本文中，先利用生物素Biotin的RNA探针（具有带m6A修饰的GGACU）进行RNA pulldown，鉴定到了一类新型的RNA结合蛋白IGF2BP1/2/3。接下来还利用外源性FLAG-IGF2BP的IP手段对HEK293T细胞中的RNA进行鉴定，同时对IGF2BP家族进行敲低后检测了4个主要的基因以达到相互验证的目的。最后通过m6A-seq以及IGF2BP1/2/3的内源性RIP-seq联合分析表明，发现m6A修饰位于MYC mRNA转录本上的CRD（coding region instability determinant）区域，在METTL14敲低后，m6A水平显著降低。同时，IP结果也显示，IGF2BP结合在了CRD区域。
3.2. RIP揭示结直肠癌中YAP-YTHDF3-lncRNA GAS5相互作用循环主要的生化手段：YAP-RIP-qPCR、YAP-RIP-seq、ChIP-seq、RNA pulldown期刊及影响因子：Molecular Cancer (IF=10.67), 2019 18(1):143首先，作者通过RIP-seq，从YAP结合的lncRNA中筛选出8个与癌症相关的lncRNA。再根据是否与结直肠癌相关、是否与YAP移位相关，从这8个lncRNA中筛选得到lncRNA GAS5。
通过qPCR和WB，证实了YAP调控YTHDF3的表达：敲低YAP抑制YTHDF3表达，超表达YAP促进YTHDF3表达。通过染色质免疫共沉淀（ChIP），发现YAP结合在YTHDF3的TSS（转录起始位点）上。RIP和RNA-pull down实验证实，YTHDF3确实结合到了lncRNA GAS5上。主要的生化手段：内源性YTHDF1-RIP-seq，外源性FLAG-YTHDF1 rescue实验期刊及影响因子：Nature Communications (IF=11.878), 2019 10(1):4892主要的生化手段：内源性SIALKBH2-RIP、外源性HA-SIALKBH2的WB、外源性eGFP和HIS免疫荧光期刊及影响因子：Genome Biology (IF=14.028), 2019 20(1):156为了在番茄中验证S1ALKBH2去甲基化酶的活性，作者将S1ALKBH2蛋白的CDS与HA标签蛋白进行融合，并在本氏烟中进行瞬时表达。免疫印迹分析显示S1ALKBH2被成功表达。LC-MS/MS检测整体mRNA上的m6A水平后发现，与对照的空质粒载体相比，S1ALKBH2表达会导致mRNA整体m6A水平出现显著下降。这表明S1ALKBH2具有m6A去甲基化酶活性。作者将S1ALKBH2的CDS在C端与eGFP荧光蛋白进行融合后，将构建好的载体用农杆菌侵染本氏烟，然后将分离好的原生质体在共聚焦显微镜下进行观察。
结果表明，带有eGFP标签的S1ALKBH2在内质网中出现了强烈的荧光信号，而eGFP对照仅在除了液泡腔外的整个细胞中产生了荧光信号。SlALKBH2-eGFP的荧光信号与带有His-Asp-Glu-Leu（HDEL）标签的红色荧光蛋白（RFP-HEDL）进行了共定位，证实了S1ALKBH2的确定位在内质网中。作者在番茄中使用对SlALKBH2进行RIP实验后发现，S1ALKBH2蛋白和SlDML2的mRNA之间存在直接互作，而与NR或FUL2的mRNA没有直接互作。