用户10分文章 | m6A lncRNA GAS5抑制结直肠癌发生且受到YTHDF3负调控 | m6A专题

论文标题：Long noncoding RNA GAS5 inhibits progression of colorectal cancer by interacting with and triggering YAP phosphorylation and degradation and is negatively regulated by the m6A reader YTHDF3

刊登日期：2019年10月

发表杂志：Molecular Cancer

影响因子：10.67

研究机构：中山大学孙逸仙纪念医院，第一作者倪雯博士

摘要

YAP是Hippo通路的关键分子之一，与肿瘤发展进程密切相关。YAP是否受到LncRNA的调控、受到何种LncRNA调控目前仍不甚清楚。在本研究中，通过RIP-seq，作者筛选鉴定出lncRNA GAS5，它与YAP蛋白的表达呈负相关的关系。GAS5直接与YAP的WW结构域结合，促进细胞内的YAP从细胞核移位到细胞质，同时促进了YAP磷酸化和YAP的降解，从而抑制了结直肠癌的发展进程。机制研究表明，YAP促进了m6A阅读蛋白YTHDF3的表达，而YTHDF3又可通过识别lncRNA GAS5上的m6A位点促进其降解，形成lncRNA GAS5-YAP-YTHDF3相互作用环。临床数据也证实了lncRNA GAS5表达与YAP和YTHDF3表达呈负相关。

流程图

RIP-seq筛选得到lncRNA GAS5

首先，作者通过RIP-seq，从YAP结合的lncRNA中筛选出8个与癌症相关的lncRNA。再根据是否与结直肠癌相关、是否与YAP移位相关，从这8个lncRNA中筛选得到lncRNA GAS5。

接着，在8种结直肠癌细胞中，作者通过qPCR、Northern Blot和WB检测了lncRNA GAS5和YAP的表达情况。结果显示，lncRNA GAS5的表达和YAP表达呈现出负相关的趋势。另外，通过共聚焦观察和细胞核质组分分离结合WB，作者证实了lncRNA GAS5可促进YAP蛋白在胞质内的沉积，即从核内移位到胞质内。

GAS5通过WW结构域与YAP结合

通过RNA pull-down实验，作者首先证实了lncRNA GAS5确实与YAP蛋白结合在一起。那么接下来就是蛋白互作/RNA-蛋白互作的经典套路，即通过结构域截断/截短的手段，确定两者互相结合的结构域。首先，作者对lncRNA GAS5进行截短，分出四段，在IP过程中分别去拉取YAP，结果显示只有262-480区域的lncRNA GAS5与YAP结合。

同样地，将YAP蛋白进行截断/截短，再进行RNA pull-down实验，结果得出当YAP的WW结构域被截断后，lncRNA GAS5无法与YAP蛋白结合。通过SWISS-MODEL 和 RNA structure software，作者模拟出了lncRNA GAS5与YAP蛋白结合的3D结构。

GAS5可促进YAP蛋白磷酸化和泛素化并致其降解

那么，GAS5是如何使得YAP蛋白移位到胞质内，或者说，使YAP蛋白“滞留”在胞质内的呢？YAP的磷酸化被证明可使YAP留在胞质内。作者发现超表达lncRNA GAS5后YAP与14-3-3的结合增强，反之降低。14-3-3蛋白可促进YAP的磷酸化。结果也表明超表达lncRNA GAS5增强了YAP的磷酸化，反之减少。这些证据解释了lncRNA GAS5使YAP“滞留”在胞质内的原因。

除了磷酸化，lncRNA GAS5还对YAP有何作用呢？前面介绍，lncRNA GAS5与YAP的表达呈负相关，那么它是如何调控YAP蛋白表达的呢？qPCR结果显示lncRNA GAS5对YAP的mRNA表达无影响，于是自然而然想到lncRNA GAS5对YAP有着翻译后的修饰。首先，通过蛋白稳定性实验（CHX处理），证实GAS5可降低YAP蛋白的稳定性。

通过泛素化检测，作者发现lncRNA GAS5超表达促进了YAP蛋白的多聚泛素化；相反，敲低lncRNA GAS5降低了YAP蛋白的泛素化。转染262-480区域的lncRNA GAS5也增强了YAP蛋白的泛素化，与全长的lncRNA GAS5一样。这些证据显示了lncRNA GAS5促进胞质内YAP蛋白的磷酸化和泛素化。

GAS5通过YAP抑制结直肠癌的发展进程

作者在体外和体内验证lncRNA GAS5抑制肿瘤进展的效果。体外结果显示，当超表达lncRNA GAS5后，结直肠癌细胞增殖显著减少，但YAP超表达消除了此效果；当干扰lncRNA GAS5时，细胞增殖显著增强，但YAP干扰消除了此效果。

体内结果也表明，当超表达lncRNA GAS5后，移植的肿瘤显著减小，但YAP超表达消除了此效果；当干扰lncRNA GAS5时，移植的肿瘤显著变大，但YAP干扰消除了此效果。

YTHDF3是YAP的下游靶蛋白

随后作者做了RNA-seq，期望找出YAP作用的下游新型靶蛋白。作者做了YAP敲低和GAS5超表达RNA-seq，并做交集，发现一个之前从未报道过的YAP下游蛋白—YTHDF3.

通过qPCR和WB，证实了YAP调控YTHDF3的表达：敲低YAP抑制YTHDF3表达，超表达YAP促进YTHDF3表达。

通过染色质免疫共沉淀（ChIP），发现YAP结合在YTHDF3的TSS（转录起始位点）上。

体外结果显示，当超表达lncRNA GAS5后，结直肠癌细胞增殖显著减少，但YTHDF3超表达消除了此效果；当干扰lncRNA GAS5时，细胞增殖显著增强，但YTHDF3干扰消除了此效果。

体内结果也表明，当超表达lncRNA GAS5后，移植的肿瘤显著减小，但YAP超表达消除了此效果。这些结果充分表明了YTHDF3是YAP的下游效应蛋白，介导了结直肠癌的发展进程。

YTHDF3促进lncRNA GAS5的降解

YTHDF3可促进肿瘤的发生发展，这是一个新奇的发现，那么它是如何发挥这个作用的呢？

在这里，作者与联川公司合作，进行了m6A-seq和RNA-seq，发现在YTHDF3敲低后，在CDS区、5’UTR和3’UTR区都有m6A修饰，且lncRNA GAS5上的m6A修饰占到了0.5%。将RNA-seq和m6A-seq的数据取交集，发现在YTHDF3敲低后有62个转录本同时发生m6A修饰和表达的变化。这些转录本功能多数与蛋白结合功能相关。

有趣的是，YTHDF3敲低后lncRNA GAS5的表达显著上调，这提示YTHDF3可能是通过lncRNA GAS5发挥致癌作用。m6A-seq的结果显示在lncRNA GAS5的第八和第九个外显子处有m6A修饰。

RIP和RNA-pull down实验证实，YTHDF3确实结合到了lncRNA GAS5上。

通过RNA稳定性实验 (即在细胞中加入ActD)，作者发现YTHDF3超表达降低了lncRNA GAS5稳定性，反之，lncRNA GAS5稳定性增强。同样地，当YTHDF3敲低后，YAP蛋白表达也显著下降。这些证据表明了YTHDF3通过调节lncRNA GAS5稳定性调控期表达。

临床上lncRNA GAS5 表达与YTHDF3和YAP表达呈负相关

通过收集正常人和结直肠癌患者肠道做免疫组化，作者发现确实，病人肠道中lncRNA GAS5表达显著低于正常人，且它的表达与YAP和YTHDF3的表达呈负相关。

同时，lncRNA GAS5的高表达也与病人的高存活率显著相关；相反，YAP和YTHDF3高表达则导致病人的存活率降低。这些表明了YTHDF3可作为新的结直肠癌预后标志。

小结

本文结构清晰，逻辑通顺，且具有一定创新性。它第一次揭示了m6A阅读蛋白在结直肠癌中的作用，拓宽了人们对m6A阅读蛋白功能的认识。此外，本文的独到之处还在于，在广为经典的YAP通路中做出了新意：即挖掘出了lncRNA GAS5-YTHDF3信号通路在其中发挥重要作用。这一事实充分证明，利用m6A-seq探究m6A在经典通路中的作用（旧瓶装新酒）是可以发出高分文章的。

同样，限制本文章发在更高分数杂志的因素也在于，YAP通路过于经典，创新性方面不是很足。另外，lncRNA GAS5和m6A阅读蛋白YTHDF3的功能前人已有所报道。作者也没有对YTHDF3下游的作用因子进行深入挖掘，而是选择了lncRNA GAS5作为研究的“闭环”，显得不够大气。在细节方面，如果能将有些WB图的质量提高会更有说服力。

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