DNA甲基化调控m6A甲基化影响番茄果实成熟 | m6A专题
标题：RNA methylomes reveal the m6A-mediated regulation of DNA demethylase gene SlDML2 in tomato fruit ripening
日期：2019年08月
杂志：Genome Biology
IF：13.21
机构：中国科学院北京植物研究所秦国政课题组
N6-甲基腺苷（m6A）普遍存在于真核生物的mRNA上。作为一种动态和可逆的转录后修饰，其通过RNA甲基化转移酶复合物（METTL3、METTL14和WTAP等）获得，而去除m6A修饰则是由去RNA甲基化酶FTO和ALKBH5介导。RNA甲基化阅读蛋白（例如YTH结构域家族蛋白）不直接参与m6A修饰和去修饰作用，但通过对m6A修饰的转录物的识别（RNA修饰相关蛋白&RNA甲基转移酶&RNA甲基化修饰结合蛋白 | m6A综述），介导m6A修饰的下游效应如维持mRNA稳定性（Nature：YTHDF2介导mRNA降解导致子代斑马鱼发育迟缓 | m6A专题（7）），调控可变剪接（m6A阅读蛋白YTHDC1调控mRNA可变剪切 | m6A专题），促进翻译（把m6A下游机制做深你还差一个翻译组测序）和出核转运（YTHDC1调控m6A修饰mRNA出核转运 | m6A专题）等。
在植物中，m6A甲基化的甲基化转移酶和去甲基化酶最早在模式植物拟南芥中得到鉴定，并发现m6A可以调节干细胞命运（案例解析：拟南芥m6A甲基化酶FIP37调控茎尖分生组织发育 | m6A专题），成花转变（案例解析：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变 | m6A专题）和毛状体分枝（案例解析：m6A-YTH组件调控拟南芥叶片发育时间和形态发生 | m6A专题）。但是，关于m6A调控机制的仍然有许多领域存在空白（综述-植物m6A甲基化酶功能进化及调控机制 | m6A专题）。
目前m6A修饰在园艺作物的生理过程中的特征和功能，例如肉质果实的成熟还未曾有过报道。
在本研究中，秦国政课题组通过m6A测序后发现：
m6A修饰在果实成熟过程中展现出动态变化趋势，m6A整体水平随着果实成熟逐渐下降，与DNA甲基化类似；在成熟缺陷突变体Cnr中，伴随着DNA超甲基化，m6A整体水平也更高。
m6A修饰普遍存在于番茄果实mRNA中，主要发生在终止密码子附近和3’ 非翻译区（3’ UTR）；总体而言，m6A修饰与基因转录水平呈负相关。
果实成熟过程和Cnr突变体中m6A整体水平的变化与m6A去甲基化酶基因SlALKBH2的表达有关；SlALKBH2受DNA甲基化调控。
m6A去甲基化酶SlALKBH2能够结合DNA去甲基化酶基因SlDML2的mRNA，调节其m6A修饰及稳定性；SlALKBH2基因突变后SlDML2的m6A水平升高，mRNA含量降低，果实不能正常成熟。
1. 番茄果实成熟过程中，mRNA m6A甲基化表现出类似于DNA甲基化的动态变化
DNA甲基化（5mC）已被证明在调节番茄果实成熟中起着至关重要的作用，作者利用中科院植物研究所质谱平台对果实成熟过程中DNA的5mC和RNA的m6A的动态水平使用LC-MS/MS进行了检测。果实成熟期无论是5mC还是m6A都出现整体下降，而Cnr突变体（比野生型WT具有更高DNA甲基化水平）在果实成熟时表现出更高的DNA 5mC修饰水平。
作者推测DNA 5mC和RNA m6A修饰之间可能存在关联，并且mRNA m6A可能以DNA甲基化的方式参与调控番茄果实的成熟。
2. m6A测序揭示番茄mRNA上RNA甲基化修饰规律
作者对开花后39天和42天的Cnr突变体及野生型果实样本进行m6A测序，发现组内生物学重复相关性较好。对样本中的Peak取交集后进行Peak Calling获得总计超过9000个Peak。在对Peak所对应的基因进行GO功能富集分析后发现m6A修饰在多种信号通路具有潜在功能。
大约平均有0.5-0.6个基因携带有m6A peak，与拟南芥以及其他哺乳动物的m6A测序结果相似。在包含m6A修饰的转录本中，大多数（91.73％）包含一个peak，而7.47％有两个peak，仅0.69％有三个peak，三个以上peak的只有0.11%。
使用m6A-IP-qPCR（手把手教你做m6A-IP-qPCR并计算相对表达量 | m6A专题）对三个基因精氨酸N-甲基转移酶（Solyc08g067050）、二羟基酸脱水酶（Solyc05g053540）以及核基质组成蛋白1（Solyc02g089800）进行验证，其结果与m6A测序结果全部吻合。说明m6A测序结果准确可靠。
3. 番茄mRNA上m6A修饰分布规律及motif分析
在所有样本的测序结果中，作者发现m6A修饰整体都富集在终止密码子周围和3'UTR区，与先前已发表的拟南芥测序结果较为一致。接下来作者进一步把peak落在mRNA的位置分为五个区域：转录起始位点TSS、5'UTR、CDS、终止密码子TES和3'UTR。TES上存在大量的peak富集。此外3'UTR中m6A peak富集程度也较高但仍少于TES。
使用HOMER软件对motif进行分析后发现，m6A经典的RRACH motif（或GGAC）结构并没有出现，但是植物特有的UGUAYY motif却丰度较高。另外西北农林科技大学马闯课题组在今年的Plant Physiology中也证实，玉米中也存在经典的植物特有motif URUAY（客户文章 | Plant Physiology玉米m6A进化由基因组重复事件介导）。
这说明，在植物中UGUAYY属于非常经典非常保守的motif，无论在拟南芥、玉米还是番茄都广泛存在。
4. DNA超甲基化突变体Cnr显著提升mRNA的m6A水平
为了深入了解DNA甲基化与mRNA m6A甲基化之间的功能关系，以及m6A在调控果实成熟中的潜在作用，作者对不同样本之间的m6A水平进行了差异分析。Cnr突变体绝大部分mRNA整体m6A水平均高于野生型，并用LC-MS/MS质谱得到了验证。
使用Input文库同时进行转录组分析后发现，无论是Cnr突变体还是野生型，m6A水平与基因转录水平整体上大致呈现负相关。这暗示m6A修饰可能参与了果实成熟调控。
5. 果实发育成熟相关基因在Cnr突变体中呈现高m6A修饰水平
在m6A测序结果中，作者发现了几个与番茄成熟相关的基因如SlDML2、FUL2和NR等m6A水平都出现了显著上升。S1DML2编码DNA去甲基化酶，而FUL2和NR分别编码MADS-box转录因子和乙烯受体。
这些基因在TES和3’ UTR区都有大量m6A peak富集。m6A-IP-qPCR对这3个基因进行验证后均与m6A测序结果吻合。与野生型相比，Cnr突变体中这三个基因m6A修饰水平出现显著上升但转录水平（或叫基因表达水平）出现显著下降。这表明m6A修饰与mRNA表达呈负相关。具体来说，在42 DPA的野生型果实中，SlDML2和NR的mRNA（而非FUL2）的m6A富集水平较低，同时转录水平更高。
6. Cnr突变体中m6A去甲基化酶SlALKBH2表达出现显著下调
由于Cnr是高甲基化的突变体，因此m6A水平的变化可能是由更上游调控机制DNA甲基化所介导的。作者推测Cnr突变体中m6A水平的大幅增加主要是由于RNA脱甲基酶基因的下调引起的，因为DNA甲基化通常与目标基因的表达呈负相关。
根据哺乳动物和拟南芥中已知的m6A去甲基化酶ALKBH蛋白序列与番茄基因组进行同源分析后，作一共鉴定了8个ALKBH基因，分别命名为S1ALKBH1至S1ALKBH8。这些基因都包含一个高度保守的AlkB结构域。
系统发育分析表明，番茄S1ALKBH2/3/4与拟南芥ALKBHs具有高度相似，这些蛋白已被证明与植物发育及防御反应相关。
这些数据表明，S1ALKBH2可能受DNA甲基化的调节并参与果实成熟。值得注意的是，在果实成熟期间或在Cnr突变体中，m6A甲基化转移酶基因（MAT1-3）的表达基本没有发生改变。
7. DNA甲基化调节番茄果实中SlALKBH2的转录水平
作者在番茄表观基因组数据库（http://ted.bti.cornell.com.cn ）中搜索了果实成熟过程中SlALKBH2启动子如何发生变化。另外Cnr突变体中DNA甲基化的动态变化也是作者关注的重点。结果表明，在SlALKBH2的TSS上游979-1080 bp处发现了一个差异甲基化区域DMR。野生型番茄中，该DMR在成熟过程中会发生去甲基化，而在Cnr突变体的果实中仍保持维持高甲基化状态。有趣的是，在sldml2突变体的果实中也观察到了SlALKBH2启动子的超甲基化，这表明SlDML2可能参与调控了SlALKBH2的去甲基化。
为了证实S1ALKBH2的转录受DNA甲基化的调节，作者使用瞬时表达系统在本氏烟草中评估了S1ALKBH2的启动子活性。将S1ALKBH2启动子克隆到双萤光素酶报道质粒，该质粒含有萤火虫萤光素酶（Fluc）报告基因和海肾萤光素酶（Rluc）报告基因。
作者发现，尽管比CaMV 35S启动子弱，但SlALKBH2启动子仍具有激活Fluc表达的能力。当SlDML2与携带有双荧光素酶报告基因的质粒共表达时，相对Fluc活性和Fluc转录水平出现显著上升，同时SalALKBH2启动子的DNA甲基化水平出现下降。
总之，这些数据表明S1ALKBH2转录受DNA甲基化调节，而S1DML2参与此过程。
8. SlALKBH2在内质网中行使m6A去甲基化酶功能
同源序列比对分析表明，SlALKBH2含有与拟南芥ALKBH9B（AtALKBH9B）和小鼠ALKBH5（MmALKBH5B）一样高度保守的AlkB结构域。作者在大肠杆菌中对SlaLKBH2全长序列进行了表达并添加了His标签蛋白。
对SlALKBH2蛋白进行纯化后，一带有m6A修饰的ssRNA/oligo（14nt）作为底物进行去甲基化反应。HPLC对ssRNA/oligo进行分析后发现，体外重组蛋白SALKBH2能够有效去除ssRNA/oligo上的m6A修饰。
为了进一步验证S1ALKBH2去甲基化酶的活性，作者将S1ALKBH2蛋白的CDS与HA标签单吧进行融合，并在本氏烟中进行瞬时表达。免疫印迹分析显示S1ALKBH2被成功表达。
LC-MS/MS检测整体mRNA上的m6A水平后发现，与对照的空质粒载体相比，S1ALKBH2表达会导致mRNA整体m6A水平出现显著下降。这表明S1ALKBH2具有m6A去甲基化酶活性。
作者将S1ALKBH2的CDS在C端与eGFP荧光蛋白进行融合后，将构建好的载体用农杆菌侵染本氏烟，然后将分离好的原生质体在共聚焦显微镜下进行观察。
结果表明，带有eGFP标签的S1ALKBH2在内质网中出现了强烈的荧光信号，而eGFP对照仅在除了液泡腔外的整个细胞中产生了荧光信号。SlALKBH2-eGFP的荧光信号与带有His-Asp-Glu-Leu（HDEL）标签的红色荧光蛋白（RFP-HEDL）进行了共定位，证实了S1ALKBH2的确定位在内质网中。
9. SlALKBH2介导的m6A去甲基化并增加SlDML2 mRNA的稳定性
作者使用SlALKBH2的多克隆抗体对SlALKBH2进行RIP实验后发现，S1ALKBH2蛋白和SlDML2的mRNA之间存在直接互作，而与NR或FUL2的mRNA没有直接互作。
已知m6A修饰会降低mRNA的稳定性，SlDML2在3'UTR上存在m6A修饰。于是作者将CDS和3'UTR组成的SlDML2的cDNA片段导入pCambia2300载体后，使用农杆菌侵染本氏烟进行瞬时表达。
使用放线菌酮（actinomycin D）处理后发现，SlDML2 mRNA迅速降解。但是当S1ALKBH2与SnDML2在本氏烟草中共表达时，SlDML2的m6A修饰水平显著下降，半衰期有所增加（即降解速度显著下降，SlDML2稳定性增加）。当SlDML2中m6A修饰位点中的A碱基突变为C碱基时，mRNA降解速度也显著下降稳定性增加。当SlDML2的A→C突变mRNA与S1ALKBH2蛋白共表达时，进一步降低了S1DML2 mRNA的降解率。
以上这些证据均表明，m6A修饰促进SlDML2的mRNA降解，而SlALKBH2介导的m6A去甲基化可稳定SlDML2 mRNA。
10. m6A去甲基化能够提高S1DML2 mRNA的稳定性
作者使用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建了三个纯合的番茄突变体slalkbh2-23、slalkbh2-25和slalkbh2-28，并用CRISPR-P 2.0版（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/ ）预测了七个潜在的脱靶基因后，并未发现任何脱靶事件。
通过比较野生型和突变体在39、42、47和52DPA的果实后作者发现，slalkbh2-23、slalkbh2-25和slalkbh2-28出现了果实延迟成熟现象。在野生型中，42 DPA会观察明显的颜色变化，而突变体则仍然保持绿色。在DPA为47时，野生型果实具有均匀的橙色，而突变体的果实才刚刚开始变色。这表明S1ALKBH2是果实成熟的关键基因。
随后使用LC-MS/MS检测39 DPA时野生型和突变体mRNA整体m6A水平后发现，S1ALKBH2的突变会导致mRNA m6A水平显著升高。对SlDML2 进行m6A-IP-qPCR验证后也发现，SlDML2在突变体中有更高的m6A丰度。同时对SlDML2进行常规的RT-qPCR检测后发现，SlDML2的mRNA水平显著下调，与m6A修饰水平呈现负相关。
m6A去甲基化酶S1ALKBH2调控SlDML2上的m6A修饰影响其mRNA的稳定性，从而参与果实成熟的调控。此外作者推测，m6A调控机制过于复杂，可能还有其他因素也在此过程中起到十分重要的作用。