拟南芥m6A阅读蛋白ECT2调控皮毛发育 | m6A专题

论文标题：The m6A Reader ECT2 Controls Trichome Morphology by Affecting mRNA Stability in Arabidopsis

刊登日期：2018年04月

发表杂志：Plant Cell

影响因子：8.688

研究机构：北京大学贾桂芳课题组，第一作者魏连环

前言

在去年也就是2018年4月，来自北京大学的贾桂芳课题组鉴定了拟南芥中首个m6A结合蛋白（也叫阅读蛋白）ECT2，揭示了ECT2通过结合m6A调控底物mRNA的稳定性来调控拟南芥表皮毛发育的机理。为理解重要的表观转录组修饰m6A在植物中的功能机理提供了重要线索。论文第一作者魏连环在2019年荣获北大优秀博士毕业论文。

N6-methyladenosine (m6A)是真核生物mRNA上最丰富的化学修饰。它可以分别在甲基转移酶复合物和去甲基酶的作用下可逆地生成及去除，由m6A结合蛋白识别并发挥功能。贾桂芳课题组曾发现拟南芥中的m6A去甲基酶ALKBH10B，ALKBH10B缺失会导致拟南芥显著的晚花表型，ALKBH10B通过影响FT，SPL3和SPL9的甲基化水平调控拟南芥的成花诱导（案例解析：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变 | m6A专题）。

在本文中贾桂芳课题组鉴定了拟南芥中首个m6A阅读蛋白ECT2。该研究表征了拟南芥中的YTH结构域蛋白ECT2为m6A的结合蛋白，并且发现ECT2可以通过结合m6A影响拟南芥表皮毛正常的发育。通过FA-CLIP，鉴定出全转录组水平的ECT2-mRNA相互作用位点，揭示ECT2主要结合mRNA的3'非翻译区(3'UTR),并且倾向结合保守序列URUAY (R=G>A, Y=U>A, 其中UGUAY序列 占90%以上)。使用植物细胞核裂解液进行的体外酶活实验和凝胶迁移实验（EMSA）证明UGUA序列为植物特有的m6A保守序列，且UGUm6A可以被ECT2高特异性识别。

亚细胞定位实验表明ECT2蛋白分布于细胞核和细胞质，结合高通量测序数据分析，推测ECT2具有双重功能，ECT2可能在细胞核中通过结合甲基化的UGUA调控pre-mRNA的3'UTR加工，在细胞质中ECT2促进mRNA的稳定性。

进一步机理研究发现影响表皮毛发育的三个基因ITB1, TTG1及DIS2的转录本可以被m6A修饰且被ECT2结合，在ECT2的T-DNA插入突变体中，ITB1, TTG1及DIS2的mRNA稳定性降低，mRNA表达量水平降低，继而导致ect2突变体中表皮毛分叉数增多。

ECT2功能的研究有利于进一步理解m6A对mRNA加工代谢的调控机制及m6A对植物生长发育的影响。

1. 拟南芥YTH家族蛋白ECT2在快速生长的组织中高表达且与形态发生相关

在人类小鼠等哺乳动物中，YTH家族蛋白如何影响mRNA翻译、降解、可变剪切及出核转运等功能已经有大量文献报道（1.Nature：YTHDF2介导mRNA降解导致子代斑马鱼发育迟缓 | m6A专题（7）；2.m6A阅读蛋白YTHDC1调控mRNA可变剪切 | m6A专题；3. YTHDC1调控m6A修饰mRNA出核转运 | m6A专题；4. Mol Cell：mRNA的选择性翻译受RNA甲基化(m6A)调控 | 翻译组）。

已知拟南芥一共有13个YTH结构域家族蛋白拟南芥幼苗RNA样品的qPCR分析表明，ECT2的mRNA丰度高于其他YTH域家族基因。作者还在大量拟南芥无性繁殖及生殖器官中检测到有ECT2表达，表明了该基因在拟南芥中泛表达。

作者在ECT2启动子区与GUS共表达后对拟南芥的各个组织进行GUS染色，一些组织如顶端分生组织、根尖、表皮毛及花粉等表达最为活跃。

接下来作者构建了两种不同的ECT2突变体ect2-1和ect2-2。低温扫描电镜显示两种突变体比野生型分支更宽。83％的野生型表皮毛有三个分支。约50％的ect2表皮毛（在ect2-1中为50.6％，在ect2中为43.6％）有四个分支，而ect2表皮毛的1-2％有五个分支（图2B）。两个独立的纯合ect2突变体中的表型，强烈暗示ECT2具有与表皮毛形态发生有关的功能。

2. 拟南芥m6A阅读蛋白ECT2调控表皮毛形态

ECT2是人YTHDF1 / YTHDF2 / YTHDF3蛋白的同源物，每个蛋白都包含一个YTH结构域。

作者在体外从大肠杆菌中纯化了带有GST标签蛋白的ECT2蛋白与拟南芥14天幼苗中分离的polyA RNA一起孵育，并用LC-MS/MS质谱法对binding到的RNA与未参与共孵育的对照RNA样本进行检测。

同时作者在拟南芥ect2-1突变体内，过表达带有FLAG标签蛋白的ECT2，并对ECT2进行FA-RIP。RIP产物经由LC-MS/MS检测后发现，与IgG对照相比ECT2-FLAG的IP产物中m6A比例明显更高。

为了进一步证实ECT2的m6A结合功能取决于YTH结构域的存在，作者设计功能缺失型ECT2蛋白，简称ECT2W521A/ W534A也叫ECT2m，其包含两个突变——从Trp-521到Ala和Trp- 534至Ala。接下来作者合成了一段RNA probe，并带有植物特有的UGUAA的motif，上面的第四位A碱基分别带有和不带有m6A修饰。ESMA实验表明，大肠杆菌纯化的ECT2m和ECT2相比，基本上丧失了m6A结合功能。

接下来作者在ect2-1突变体中，分别表达均由天然ECT2启动子驱动的ECT2和ECT2m。ECT2蛋白能够对拟南芥表型进行补救，而ECT2m则不能。综上所述，拟南芥中正常表皮毛形态发生需要ECT2识别和结合具有m6A修饰的mRNA。

3. ECT2同时定位在细胞核和细胞质中

已知m6A阅读蛋白在细胞中的定位会影响其调控机制，因此作者对ECT2进行了亚细胞定位。作者先用TargetP分析ECT2后发现，该蛋白没有明显的定位标签。因此作者在ect2-1突变体中过表达带有eGFP标签的ECT2，并用共聚焦显微镜进行观察根尖细胞。

结果表明，ECT2同时存在于根尖细胞的细胞核和细胞质中。作者还使用烟草瞬转模型来观察瞬时表达的ECT2-eGFP融合蛋白，也发现ECT2同时定位在细胞核和细胞质中。

ECT2的亚细胞定位表明ECT2可能在调节细胞核中的pre-mRNA加工以及涉及细胞质成熟mRNA代谢等其他方面发挥双重作用，这个结论与之前何川及杨运桂关于YTHDC1的研究内容很相似（1. m6A阅读蛋白YTHDC1调控mRNA可变剪切 | m6A专题；2. YTHDC1调控m6A修饰mRNA出核转运 | m6A专题；）。

4. FA-CLIP鉴定ECT2与RNA互作位点，揭示3’ UTR存在m6A富集

由于在哺乳动物中常用的PAR-CLIP技术在植物中无法实现，作者根据植物中已报到的FA-RIP技术与CLIP将技术进行改良，其中最核心的步骤就是使用甲醛来交联蛋白质与RNA，并将之命名为FA-CLIP。

ect2-1突变体中转入带有FLAG标签的ECT2，并对14天拟南芥幼苗的RNA进行FA-CLIP检测，共2个生物学重复。

测序结果表明ECT2靶向的几乎所有转录本都是mRNA分子，但约0.7％是非编码RNA或其他RNA。与m6A测序结果一起分析后，作者发现49.9%的peak与ECT2有重叠。对m6A和ECT2结合位点之间的距离的分析表明，m6A经常与ECT2的结合位点重叠。这些结果证实了ECT2在植物中能够识别带有m6A修饰的mRNA。

进一步分析表明，>90%的ECT2靶点都出现在了3’ UTR内。使用HOMER进行motif分析后发现，常见的m6A修饰保守motif GGACU并未出现，但是motif URUAY（R=G/A, Y=U/A）却被鉴定了出来。当对m6A测序及FA-CLIP重叠的共有ECT2 peak进行motif分析时，也再次鉴定到了URUAY。

拓展阅读：客户文章 | Plant Physiology玉米m6A进化由基因组重复事件介导 中也同样鉴定到了URUAY motif，并在体外实验中，通过人工合成的RNA oligo/probe证实URUAY motif独特性。

5. URUAY motif是植物特有的m6A motif

为了证明该URUAY motif上的A真正带有m6A修饰（即可以被内源性m6A甲基化转移酶催化），作者从拟南芥幼苗中制备了细胞核提取物（核质分离）。作者先从测序结果已存在的结果中挑选了两条mRNA，并进行体外合成部分oligo，已知两条oligo带有UGUA motif。随后作者将[γ-32P]引入到UGUA motif中，确保[γ-32P]-腺苷在这两条probe中的均匀分布。接下来以这些probe作为底物与拟南芥细胞核提取物一起在体外进行反应。最后用RNase P1处理并用薄层色谱TLC监控m6A整体修饰状态。

利用植物核蛋白进行的体外实验清楚地表明，内源性植物m6A甲基化转移酶可以对FA-CLIP及m6A测序结果中带有UGUA motif的已有oligo有m6A修饰作用。

为了更详细地探讨体外m6A甲基化活性，作者构建了另外三个包含均匀[γ-32P]-腺苷标记motif的oligo：UGUA、 GGACU和随机生成的CUAUG。已知GGACU是人类和其他真核生物中共有motif。用这三种oligo作为底物进行的分析表明，存在于核蛋白提取物中的拟南芥m6A甲基化转移酶对UGUA motif的甲基化活性比对GGACU或随机序列CUAUG的甲基化活性更高。

所以UGUA motif是植物中特有的m6A motif，可以被内源性的拟南芥m6A writer修饰。

考虑到人的YTH结构域家族蛋白可以读取m6A修饰的RRACH位点，接下来作者比较了ECT2对UGUA和GGACU两种motif的结合能力。

作者合成了包括UGUXA、GGXCU等在内总计六种motif的42-mer的oligo来进行EMSA实验。结果表明，ECT2仅与包含m6A修饰的42-mer RNA结合。ECT2能够识别具有相似结合亲和力的UGU(m6A)A和GG(m6A)CU，且结合能力比m6A修饰的随机motif序列高3倍。

人YTH结构域蛋白可结合m6A修饰的GGAC序列。作者发现拟南芥的YTH家族蛋白ECT2可以与m6A修饰的UGUAmotif结合。ECT2对m6A修饰的UGUA的结合能力类似于人YTH结构域家族蛋白对m6A修饰的GGACU的结合能力。这表明ECT2可能通过特异性识别植物细胞中的m6A甲基化的UGUA起作用。

综上所述，ECT2可以特异性识别植物中独有的m6A motif URUAY，该motif主要富集在拟南芥mRNA的3'UTR区。

6. ECT2参与mRNA 3’UTR的加工并维持其稳定性

已知成熟的mRNA都会被添加多聚腺苷酸化也就是polyA信号。这种信号如果细分的话还能再被分成几个不同组别：polyA上游20-30nt位置，距离polyA上游40-150nt位置（也叫远上游元件FUE）以及polyA上游20-40nt左右的下游元件等。已知ECT2与m6A修饰的URUAY motif序列结合，作者注意到该motif与polyA信号用于多聚腺苷酸化有关。在拟南芥中，该序列通常出现在FUE中。

为了调查受ECT2结合的UGUA位点是否以某种方式与polyA信号相关，作者计算了polyA位点与ECT2结合位点（FA-CLIP peak）或突变之间模拟peak的距离。与模拟结果不同，在FUE聚腺苷酸化信号的特征区域中，ECT2结合位点的位置始终位于polyA位点上游30-150nt。

亚细胞定位表明，ECT2在细胞核和细胞质中。因此，作者推测ECT2在其目标转录本的FUE中与m6A修饰的polyA信号序列UGUA结合，从而促进其聚腺苷酸化，这表明ECT2可能调节细胞核中的某种替代性聚腺苷酸化和3'UTR加工。ECT2可以选择性地结合含m6A的polyA信号FUE，从而募集聚腺苷酸化机制以进行替代的聚腺苷酸化和进一步的3'UTR处理。

鉴于ECT2既位于细胞核又位于细胞质，并且先前的报道中已被证实在细胞质中，m6A阅读蛋白YTHDF2能够对mRNA进行降解（Nature：YTHDF2介导mRNA降解导致子代斑马鱼发育迟缓 | m6A专题（7） ）。作者想进一步通过转录组证实自己的猜测。

与预想结果有所不同，转录组数据表明ECT2不会促进mRNA降解，反而可能会维持mRNA的稳定性。考虑到转录本3'UTR的长度会影响microRNA与RNA结合蛋白对mRNA降解的结合，作者只能推测ECT2可能会促进3'UTR上m6A修饰介导的交替聚腺苷酸化。具体的机制仍有待进一步挖掘，但在本章节并未详细说明。

7. ECT2调控拟南芥重要的生物学功能如表皮毛形态发生

通过对转录组数据进行深入挖掘分析，作者发现ect2-1突变体中有105个显着上调的基因和92个显着下调的基因，并用DAVID算法对通过FA-CLIP分析鉴定出的ECT2靶向基因和通过mRNA序列分析鉴定出的197个差异表达基因进行了GO富集分析。结果表明，大量基因富集在mRNA加工、磷酸化、温度胁迫刺激反应及表皮毛发育等几个重要的基因功能注释上富集。

8. ECT2维持靶向mRNA分子稳定性调控表皮毛形态发育

基于前面大量测序数据挖掘，作者将目光锁定在12个与表皮毛形态发育相关的ECT2靶基因上作为候选。最后作者选择了TTG1、ITB1和DIS2这3个基因。

这3个基因的m6A测序数据以及FA-CLIP数据中都在3’UTR区域出现重叠peak，并得到FA-RIP-qPCR和m6A-IP-qPCR验证。

与野生型相比，ect2-1中TTG1、ITB1和DIS2的表达水平显着降低。为了证实前面的猜想，作者使用放线菌酮处理后来对3个基因的mRNA半衰期进行检测。结果表明与野生型相比，ect2-1中3个基因的转录本降解更快。阴性对照基因AT2G07689在ect2-1和野生型中的mRNA半衰期相似。

ECT2的亚细胞定位和高通量测序数据分析表明，ECT2可能在调节细胞核中的3'UTR加工并直接促进细胞质中mRNA的稳定性中起作用。TTG1、ITB1和DIS2的mRNA稳定性可能是ECT2双重功能之一。ECT2的m6A结合功能如何影响mRNA稳定性的确切途径尚待进一步研究。

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