贝勒医学院博士B站直播问答合集

近日，我们联川美国研发中心高级科学家；贝勒医学院博士、MD Anderson博士后刘志毅老师在B站直播讲解了ChIP-seq的技术方法及实验思路，场面十分火爆；

错过了直播的老师可以扫描下方二维码进行回看；

对于课程中的疑问，我们做了整理，并给出了文字版解答；

1、超声一步是非常重要的吗

应该说，DNA片段化的程度很重要。DNA片段化一般是用超声或是酶切来是实现。超声波的参数设定、超声时间长短根据不同组织、细胞都不太一样，需要根据课题做预实验来进行优化。具体就是在超声后纯化DNA跑胶来确认。一般片段是100-200bp，但是根据下游的文库构建要求，有可能需要再调整优化。

2、转录因子下游，也是RNA-seqma ,需要联合ATAC-seq吗

这个问题可能缺失了部分课题设计信息。我的理解是如果深入研究下游转录因子，RNA-seq可能是必做的——因为需要评估表达变化。ATAC-seq可以加入，那就是要拿染色质功能拓扑结构来说事了～～也许会有很好的story。

3、TCGA数据库是什么，如何使用

TCGA 全称是The Cancer Genome Atlas，集合了各种肿瘤组织的组学研究的结果和数据，质量很高，结果很全，针对其数据分析的工具很多。建议大家在寻找、设计课题的时候先来看看、调研此数据库。网址：https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga/studied-cancers

另外，有推荐一个在线工具来研究TCGA，大家访问一下，试着玩玩看：https://www.cbioportal.org也许会带意想不到的惊喜哦。

4、 PER2 locus的ABCD是怎么划分

这个应该是取决于能够找到的、可以work的amplicons。一般我们做ChIP-PCR验证时，扩增子不能太长，大概100-200bp。论文作者应该是设计了好几对引物，ABCD被选出来是因为扩增的特异性、稳定性都很好的缘故。没有什么很tricky的细节在里面。

5、eRNA跟增强子具体什么关系

eRNA是enhancer RNA的简称。非常简单的理解就是：当一个enhancer处于活跃状态的时候， 其区域上的eRNA也是活跃转录的。当然有关eRNA的理论和调控机理很复杂，有兴趣的可以研读一下这篇综述：Li, W., Notani, D. & Rosenfeld, M. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet 17, 207–223 (2016). https://doi.org/10.1038/nrg.2016.4 （下不到的可以找我要pdf啊）

6、不同物种ChIP的信号是否保守

简单地说，近缘种间ChIP信号有可能相似，远源种差别可能很大。但是ChIP信号更多的是跟疾病模型、信号通路等具体细节紧密相关的。简言之，调控机理相似的，ChIP信号会应该更相似一些。

7、超声吧基因打成小片段，还怎么做qPCR呢

超声波片段化目的是为了有效的IP，qPCR的扩增子一般设计成100-200bp，都很小，是在片段化范围内的，是可以扩增出来的。

8、 PIR-seq样品怎么选择有代表性的

你肯定是要选那些表型明确，便于分析的样品或组织啦。这个问题要结合具体课题、模型来探讨。

9、 一般怎么确定所研究的组织

这也是个范围很大的问题，可能要结合你的课题来讨论。举例来说，跟你的疾病模型有关， 比如研究癌症的，就要根据肿瘤类型及molecular pathogenesis来选，是腺癌的，就不要选到鳞状细胞/上皮癌组织里去。然后就是你所研究的信号通路或是表观遗传学调控要在你所研究的组织里有明显表型——有时是需要一些先验知识的，有些是需要一些预实验来先试试。

10、怎么确定转录因子是激活还是抑制下游基因

要做实验来验证啊。最简单的设计就是：过表达或是敲低这个转录因子，做一下它下游基因的表达（用qPCR）。

11、Input出暖DNA电泳条带浅是什么原因

深浅不要紧，重要的是带型，要呈弥散性的小片段就好。

12、两个技术重复样品相关性怎么评价

最简单的，算算两者之间的correlation coefficients相关性系数。越高越好。呈现结果的时候，做一下PCA plot就很能说明问题了。

13、Black list怎么收集，对结果影响大吗，可否不去除，因为没有很多input数据

需要查阅文献和数据库，没有一个广泛的解决方案，有一些生信工具可以帮助去除这些区域。可以参考一下这篇文章：https://www.nature.com/articles/s41598-019-45839-z

和这篇文章：https://www.liebertpub.com/doi/pdf/10.1089/cmb.2019.0295

能去就去一下，增加结果的validity，对发表没有坏处。不过，如果你的区域信号是明显可以判断是真实的，可以跳过这一步。

14chip所谓的生物学重复是否来自同个样品

严格说来，还是要选在同一处理条件下的独立样品个体。

15、水稻根部ChIP好做吗

我没有做过水稻组织，但是可以给一些建议——试一下固定和片段化的参数，评估一下是否可以得到比较好的片段化DNA。然后就是要评估你的IP效果好不好。如果都不错的话，大概率你的实验能成功。水稻是比较常见的材料，文献也不少，应该不难做的。

16、chip-seq uniqie reads比对率 50%是否正常

我觉得问题不大。只要你比到的区域足够支持你的结论就行了。当然，也可以多做几次测序，把数据量提上去。这也涉及到你的生信分析处理，其实操作空间很大。

17、请问做TCGA的数据分析如何祛除不同样本的批次效应？比如不同批次样本不同批次建库等

批次效应是很常见的问题。有很多R包可以去除批次效应。可以去搜索一下查查看哪个R包好用。

18、做完TCGA分析用chip-seq证明行吗？还是做了chipseq还得实验证明？

看你想发什么级别的杂志啦，一般说，ChIP-seq做完了是要实验再验证一下的，这样结论才更convincing，不是吗？

19、找某个基因上游调控直接基因chipseq行吗？

这也是个很宽泛的问题。直接找到上游的结合蛋白比较难哦。我倒是建议做一下蛋白组学去找它直接的互作蛋白，这需要精细的实验设计。ChIP-seq/PCR可以用来验证你的发现。

20、要做chip-seq组蛋白修饰，人的组织样本，关注的是这几个组蛋白：H3 k4 ME1，H3 k4 ME3，H3 k36 ME3，H3 k9 ME3，H3 k27 ME3，客户比较关注peak峰的数目，因为他怕IP出来的结果跟input的比较没有意义，我们这边做出来的peak峰是多少呢？还有用的试剂跟抗体是哪家公司是不是影响也很大，比如abcam  CST等

峰的数目实际上和你的上游实验好坏紧密相关。Peak数目很难给出固定的数字，在去除input背景信号后，越多当然越好。但是，我们更关注实验组的峰型、信号强弱要与你的实验对照组有明显不同才好。

ChIP-seq的结果和抗体是紧密相关的。大家可以试试Abcam、Cell Signaling家的抗体，我的经验是这两家的组蛋白修饰抗体还不错。Millipore家的一些抗体也还行。还有一个途径，就是去看已发表的文章，如果所有文章都用同一家的产品，那不是很能说明问题吗？

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