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本次课程介绍的是“m6A高分文章中高频实验及目的”，由于千人同时在线提问，场面过于火爆，有部分老师的问题未来得及第一时间解答，于是我们的讲师连夜奋笔疾书，将未回答的问题给出了解答。酶标仪法只做m6A吗，可以测其他类型的甲基化修饰吗？A：目前试剂盒除了m6A之外，还有DNA甲基化5mC 5hmC以及RNA的m5C修饰等都能做。但是我建议做质谱LC-MS/MS会更好在植物中，果实品质存在差异，能否可以做m6A的检测/哪里可以做预实验/联川能否提供预实验的方法A：还是我们推荐的三种方法——Dot Blot、酶标仪和LC-MS/MS。第一种方法部分文章用的比较多，折中但是方法比较复杂，条件摸熟练后做出来结果会非常漂亮。第二种成本低速度快2小时就出来结果，但是偏定性，看下趋势就行了，三种方法里最不靠谱但也是最便宜最快的。第三种就是最准的，但是要找分析化学的人来帮忙，比如食品科学分析化学农药残留等，目前中科院以及一些高校院所有公共平台都有开放做。如果质谱做出来还是没差异，基本上没有做m6A的必要了。酶标仪优势就是快。A：暂时没有，这块就像我说的，得老师自己做啦。protocol已经在PPT中展示Nagarajan et al. (2019). Dot Blot Analysis for Measuring Global N6-Methyladenosine Modification of RNA: Methods and Protocols.与对照组相比，实验中甲基化基因和去甲基化基因都是高表达的，怎么解释METTL3的表达量显著升高，但是整体m6A水平降低，这个结果可能吗？A：第一看哪个甲基化酶本底表达更高，举个例子METTL3本底表达为1000，FTO或WTAP才10，那么METTL3起到作用更大。qPCR也可以看CT值。另外WB或IHC会更准。如果有细胞系，直接进行siRNA/shRNA看下哪个表型更为明显。A：看自己研究方向。已知lncRNA和circRNA上带有大量的m6A修饰，但是对应的reader蛋白和RNA结合蛋白却各有不同。我建议可以缓一缓。看自己的研究目的。目前有2个大方向，上游的机制很清楚，下游往lncRNA和circRNA拓展，这种要大海捞针了。另一个是lncRNA和circRNA我知道了，我试试看是否带有m6A修饰，接下来的套路跟reader有关，比如YTHDF2介导m6A circRNA的降解，YTHDC1介导m6A circRNA的出核等。A：您指的是测序还是其他后期验证。以测序为例，看文献，看数据，知识储备决定一切。这个是苦功夫没有捷径。当然有2个方向可以选择。如果是我的话根据自己课题组前期积累，我会有一个gene list库，大概40多个，涉及磷酸化和JAK-STAT通路的，那么无论数据怎么变化只要有差异的基因在我的gene list中我就会往下做。另一个是根据统计学差异来筛选出倍数最大 pvalue最小的基因，反推回去通过文献来确定生物学故事。A：maybe，但是这类文献我目前接触不多。还是根据生物学的故事来吧，可以结合RNA pulldown看看。通常情况下，RNA在加工的过程中会被各种剪切酶给处理掉，很少存在内含子情况。放线菌素d实验是不是不能用于线粒体修饰mENA的降解检测，线粒体mRNA的m6A修饰存在吗？A：线粒体上mRNA的m6A修饰确实是一个热点，但是我对这块不是很熟悉，这个不敢回答。理论上讲，只要在胞浆中涉及到翻译过程的话，成熟的带有polyA结构的mRNA上有核糖体存在就有翻译蛋白现象发生。可以查下对应的资料。A：只要你根据自己领域的单词+m6A作为关键词，去pubmed或Google Scholar搜索相应文章，若数量不多，都是值得挖掘的新方向。前提是对m6A本身基础已经了解很深，只需要往自己的故事上套即可。前期基础薄弱或者初次了解的老师可以购买我们的m6A一本通学习更系统的m6A知识。两组的整体m6A水平有差异，m6A-seq能找到有差异表达的基因，但两组酶的表达没有差异，这类该怎么入手？A：这个问题非常好！告诉你一个我曾经用过的办法，虽然很烧钱但是很有用。某人拿到了几十对临床样本，买了21个抗体，然后做了1000多张组织芯片（免疫组化）终于找到了阳性很大的那个蛋白。A：阅读蛋白reader不涉及直接参与调控m6A修饰水平的升高或降低，但是reader能够识别带有m6A修饰的mRNA。不同reader功能有所不同，如YTHDF2介导mRNA降解，YTHDF1介导mRNA的翻译等。具体功能如下所示A材料和B材料中去甲基化酶的表达量有显著影响，但表达量都不高，能否对m6A造成影响？A：有没有影响得看这几个核心因素：① 是否对表型有很大的影响；② 是否样本之间整体m6A水平出现差异如果有一个甲基化酶的突变体了，还需要用到Dot Blot等方法验证这个突变体里面的甲基化含量吗？A：必须的，我们PPT里的几个案例都做了，有些是做Dot Blot，有些是做了LC-MS/MS。不然你想啊，怎么证明你的甲基化酶是敲除成功的呢？即便是如FTO等基因你敲掉了，qPCR也差异了，但是对应的m6A修饰水平无差异，那么也是不能往下做的哦。这个是环环相扣的因果证明，缺一不可。A：通常来说，蛋白水平的话差异或者mRNA水平差异他要根据生物学故事来。比如一个细胞系上FTO敲了，phenotype很明显，那么你测序结果里才1.5倍的差异也是有意义的。否则无意义。通常我们客户免疫组化临床样本或者动物模型做出来阳性大概2个++就能说明问题了。临床样本测序的话，一般mRNA水平的话通常来讲2倍是常规操作。A：KO模型和KD的话还是有一些区别的，这块内容过于复杂，我们可以私底下详聊。包括你敲除的是哪个外显子，乃至哪个外显子上的domain也是最后效果有所不同。通过前期预实验，一经发现某个m6A的reader在某个疾病模型有表型，后面要怎么挖掘机制比较合适？A：可以做某个reader的RIP-seq，同时模型或者细胞系上这个reader也可以敲低or过表达观察phenotype。结合RIP-seq乃至m6A-seq，取交集后缩小基因范围，找到自己感兴趣的靶基因往下游验证，并建立起因果性。找到新的METTL家族的成员，如何实验的方法确定它确实有甲基转移功能A：目前哺乳动物不太可能存在新的METTL家族成员有m6A相关的研究，这个领域早在六七年前已经被挖矿挖的差不多了。植物倒是有可能。如果要验证新的甲基化酶的功能，得纯化该蛋白，然后与体外合成的带有m6A修饰的oligonucleotide进行一系列in vitro反应，还要打质谱，还要对METTL酶上催化的domain做各种丧失功能单碱基点突变等。如此繁琐的工作还是交给生物化学家吧。METTL3表达发生变化是m6A修饰变化的先决条件吗？A：理论上是，此外还有其他的writer和eraser。详见下图对照组跟实验组m6A测序完了，筛选基因时，能选择差异倍数最高的进行后续实验吗，会不会有假阳性？A：可能存在，但是概率不大。差异倍数高的前提是，这个RNA分子本身本底含量也很高。例如200g面条 vs 400g面条，0.2g米饭 vs 0.4g米饭，你觉得同样是升高两倍，哪个会更容易吃饱呢？希望这个不太恰当的例子能够帮助到你。我们这边推荐还是选择一些特定的靶基因，尤其是前期被人反复验证的老基因来做验证，我们只是从m6A角度来重新阐释机制会更加保险。没接触过分析化学，LC-MS可以自己做并且分析吗，难度大吗？A：找各大高校公共实验平台的负责人，尤其是液相色谱的实验员。目前北京和上海的中科院系统的公共平台已开放该服务，费用约为500元。敲低甲基化酶，发现基因的mRNA水平是下降的，但是同步去检测reader相关蛋白，发现敲低甲基化相关蛋白的条件下，reader蛋白mRNA水平也会改变，这个是有什么联系吗？A：可能也不一定有必然的联系，it’s a long story. 暂时无法判断，如果这个reader你敲除后的表型和甲基化酶敲除的表型和接近，说明彼此能补救，那么可能真的有关系。看相互rescue的结果吧。A：阴阳性对照我们建议选择带有m6A修饰的和不带有m6A修饰的两段基因按照1:1混入需要验证的total RNA中，浓度等要设置好。这边常见的方法是使用，合成一段Unmodified Control RNA (Cypridina Luciferase)长度为1706 nt，再去合成一段m6A Control RNA (Gaussia Luciferase)长度为 603 nt。其中后者m6A修饰比例为20%。通过公式计算出抗体的好坏与非特异性IP效率。如果预测到靶mRNA 3’UTR端有甲基化修饰，想用荧光素报告基因的方法证明m6A可以促进mRNA翻译效率，构建质粒时，是不是需要把3UTR端也包含进去？A：有些paper里只转3UTR序列，并不是全长序列。A：存在，只不过测到了修饰后，下游的故事怎么讲。这类文章不多更多是后面的生物学故事不太好延伸，仅仅罗列这些RNA有m6A修饰已经无法发表高水平论文了。A：PPT中已经罗列三种方法。Dot Blot、酶标仪和LC-MS/MS。第一种方法部分文章用的比较多，折中但是方法比较复杂，条件摸熟练后做出来结果会非常漂亮。第二种成本低速度快2小时就出来结果，但是偏定性，看下趋势就行了，三种方法里最不靠谱但也是最便宜最快的。第三种就是最准的，但是要找分析化学的人来帮忙，比如食品科学分析化学农药残留等，目前中科院以及一些高校院所有公共平台都有开放做。如果质谱做出来还是没差异，基本上没有做m6A的必要了。酶标仪优势就是快。如果小的课题组，没有那么多经费支持，有哪些备选研究方案，不追求高分文章，可以告知下研究思路吗？A：很抱歉，m6A是一个特别烧钱的实验。如果只追求小文章的话，一般假如真的发现两组样本例如组A vs 组B有甲基化水平差异，那么测序的话3 vs 3比较合理。罗列下测序数据即可以发表在Frontier系列杂志，大约3-4分左右。最多补充几个qPCR。A：得懂分析化学，尤其是核酸这块的实验员老师。可参照protocol——Bifeng Yuan (袁必锋) (2017) Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for Analysis of RNA Adenosine Methylation. Methods in Molecular Biology, 1562, 33。来询问相应老师。A：NGS测序如果不是从事生物信息以及相应方法学研究的老师，只需了解常规信息即可。联川生物结题报告中就有相应资料，分别在方法学和后期综述推荐中都有涉及。我用酶标仪法测的m6A修饰水平，为什么METTL3的敲除组修饰水平没有明显降低，相反的还有上升的A：有可能的。我建议多做几次预实验和重复，看下是否都吻合。另外可能有其他因素干扰了，METTL3不是主要因素，而是辅助因素。也就是引起m6A水平降低的源头你找错了。个人觉得LC-MS/MS会更靠谱点，酶标仪有时候会不太稳定。RRACH这个MOTIF有没有方向性，HCARR是不是也可以？A：RRACH或者简化版的GGAC具有链特异性（链方向性），所以答案你懂了吗？YTHDF2对非编码RNA，比如lncRNA的作用也是促进降解吗？做了测序后，挑选出的基因进行验证的效率有多高，存在挑的高表达的基因验证不出来吗，验证的INPUT还得重新用m6A抗体拉下来做吗？A：验证效率多高，因素过于复杂，我说几个会影响普通PCR验证的因素吧，这边还不涉及IP-qPCR。包括你的样本来源组内是否差异很小（如不同病人和不同细胞系之间，肯定是细胞系差异小），验证的基因本底表达高不高等。回到你的问题，想要验证成功率高，差异的基因要做IP-qPCR，必须本底表达足够高，引物设计足够特异。另外Input是对照，不需要用m6A抗体去拉。详情请关注联川生物的m6A一本通，里面详细介绍了m6A-IP-qPCR。也可以欢迎收听我们的公开课——m6A-IP-qPCR。A：尽量选择RRACH的motif，p越小越好。当然如果结果不满意，可以联系我们售后人员剔除部分测序噪音后重新进行预测。不用原核表达的蛋白实验，是因为原核表达的蛋白没有修饰吗，还是因为其他原因？如果用原核表达的蛋白实验，得到的实验结果会不会是错的？
A：折叠错误等原因，还有就是表达的蛋白氨基酸AA数过大都会有影响。相比之下真核表达如酵母等会比大肠杆菌要来得好。很多时候大肠杆菌只能表达蛋白中有催化功能那一小部分domain所包含的蛋白or多肽。A：临床样本推荐做免疫组化，因为WB的话看浸润程度和空间表达没有IHC好。METTL14对于这个起甲基化作用中的作用大吗，仅仅敲低METTL14是否也能出现明显表型？A：有可能没有表型，有可能m6A水平无差异。这个原因很复杂，可能你干扰效率不高，可能敲的区域不对，可能压根差异所引起的表型差异主效因素不是METTL14。要辩证看！建议可以读一些文献找下思路。敲低甲基化的酶，但是有其他因素引起作用，从而导致某个基因的甲基化水平没有改变，比如敲低METTL3，但是去甲基化酶的表达也还是降低的？A：有可能，这类情况比较复杂，这边不太好下判断。但是还是要看整体m6A水平是否出现变化，下游去甲基化酶如果降低了，那么细胞系上敲低该去甲基化酶表型影响是否明显。因为有些文章已经出现了甲基化酶调控甲基化酶从而形成一个loop循环的情况，形成越来越强的正向调控等。我们的培训仍在继续，今晚7：30，依旧是大家熟悉的沈工，带来《m6A高分文章中高频图表解析》，扫码即可开启课程预约！