文献解读：MSI-H及MMR-D型结直肠癌的免疫治疗及耐药机制
0背景
同源修复基因（Mismatch repair gene, MMR gene）包括了MLH-1, PMS-2, MSH-2和MSH-6，在DNA同源重组修复中有重要作用。MMR基因缺失会导致MMR缺陷（MMR deficiency, MMR-D），从而导致微卫星不稳定的发生（microsatellite instability, MSI）。MSI的发生导致了临床上结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的恶性程度增加，表现为肿瘤突变负荷TMB增高及肿瘤浸润性淋巴细胞（tumour-infiltrating lymphocytes, TILs）数目的增高。存在MSI的CRC可以分成两种表型：MSI-H及MSI-L。在一些较大的panel中，检测到>30%markers不稳定性的CRC被判定为MSI-H，检测到10-30%Marker不稳定性的CRC被判定为MSI-L。MSI-H型通常会导致更高的DNA移码突变水平，间接导致TMB的身高。尽管MSI-L型的CRC的突变负荷要高于微卫星稳定型的CRC，但这两种疾病的表型基本一致。
MSI导致的移码突变通常会引起大量新抗原的产生。与点突变不同，移码突变会使整个蛋白质的结构发生改变并产生新的抗原表位，使MSI-H/MMR-D表型的肿瘤相比于MSS表型肿瘤免疫原性更高。因此，MSI-H/MMR-D表型的肿瘤通常具有更多的TILs，其中许多可以直接靶向针对肿瘤相关新抗原。
目前，FDA已经批准了两种针对PD-1的抗体帕姆单抗Perbrolizumab（Keytruda，K药）和纳武单抗nivolumab（Opdivo，O药）用于治疗转移性结直肠癌，对MSI-H/MMR-D患者具有显著益处。近期，一种完全人源化的CTLA-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4）单克隆抗体伊匹单抗imilimumab（Yervoy）被FDA批准与纳武单抗联合使用，用于治疗先前接受过化疗的MSI-H/MMR-D结直肠癌患者。在Perbrolizumab和nivolumab-imilimumab临床研究中，发现二者的客观缓解率（objective responses, ORR）分别为40%和56%，表面有一些MSI-H/MMR-H患者存在对免疫检查点抑制剂固有的或者新生的耐药。此外，患者逐渐对这些药物产生耐药性，这意味着肿瘤基因组和肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）可能发生进一步的改变，导致对免疫检查点抑制剂的获得性耐药。
本文主要介绍了免疫治疗在MSI-H/MMR-D结直肠癌患者中的疗效，重点介绍了免疫检查点抑制剂的作用，并阐述了免疫检查点抑制剂获得/新生耐药的潜在机制。
1免疫检查点抑制剂在MSI-H/MMR-D CRC患者中的应用
有几项研究分析了MSI-H/MMR-D结直肠癌患者肿瘤边缘存在的TILs的意义，在III期结直肠癌患者中，肿瘤中TILs更多的患者具有更好的预后生存情况与更低的远端转移风险。有学者提出了Immunoscore分类系统，基于CD3+和CD8+T细胞的在I-III期肿瘤中的浸润程度，解释了TILs在临床上的具体意义：无论MSI的高低，TILs都可能影响CRC患者的预后情况。基于这些结果，研究者们设计了一系列临床试验来评估免疫检查点抑制剂是否能增强MSI-H/MMR-D CRC患者的TILs的抗癌活性。
1.1免疫检查点抑制剂的疗效
帕姆单抗是一种针对PD-1的人源化IgG4抗体，在一项II期临床研究评价了MSI-H/MMR-D CRC患者，MSS CRC患者及其他MSI-H/MMR-D的非CRC患者对帕姆单抗的响应情况。参与本研究的患者每2周静脉注射pembrolizumab，剂量为10 mg/kg。作者报道了MSI-H/MMR-D CRC患者的客观缓解率(ORR)为40%(4/10)，而MSS CRC患者没有获得缓解(表1)。在12个月的随访期内，MSI-H/MMR-D组患者的无进展生存率（Progression-free survival, PFS）及总体生存率（overall survival, OS）均未达到中位值，而在MSS CRC患者中，PFS和OS分别为2.2个月和5.0个月，在非CRC的MSI-H/MMR-D患者中，PFS和OS获益也很明显。这些引人注目的结果导致FDA批准在MSI-H/MMR-D癌症中使用pembrolizumab，而不需评估具体的肿瘤类型。
Nivolumab是一种完全人源化的针对PD-1的IgG4单克隆抗体，也在MSI-H/MMR-D CRC患者中进行了研究。在一项对74例MSI-H/MMR-D型转移性结直肠癌患者的II期临床试验中，患者每2周接受3 mg/kg的静脉注射nivolumab，直到病情进展。作者报告的ORR为31%(23/74)，疾病控制率(DCR)为69%(51/74)，无治疗相关死亡率。基于这些结果，FDA于2017年7月批准nivolumab用于MSI-H/MMR-D型转移性结直肠癌患者。
Ipilimumab是一种针对CTLA4的单克隆抗体，与Nivolumab一同联合使用用于治疗MSI-H/MMR-D型转移性结直肠癌患者，相关结果已于2018年发表。共有119名患者接受了3 mg/kg的Nivolumab和1 mg/kg的ipilimumab的联合治疗，其中联合给药每三周给药1次，共给药4次；Nivolumab单独治疗每2周给药一次，直到病情进展。12周的给药结束后，ORR和DCR分别为55%和80%。在同一研究中，9个月和12个月的PFS分别为76%和71%，这表明ipilimumab和nivolumab联合使用可能比单独使用nivolumab更有效地控制疾病。该临床试验的结果导致了2018年7月FDA加速批准ipilimumab联合nivolumab用于治疗MSI-H/MMR-D 转移性结直肠癌患者。
表1 研究免疫检查点抑制剂对MMR-D/MSI-H型CRC患者的益处的临床试验
1.2 免疫检查点抑制剂的副作用
虽然免疫检查点设计的初衷是为了增强机体对癌细胞的免疫应答，但免疫不良反应（immune-related adverse events, IRAEs）会导致药物对非癌组织产生反应。虽然免疫检查点抑制剂可以被认为是相对较好的耐受性，IRAEs依然可能产生重大的发病率和死亡率。值得注意的是，在nivolumab和ipilimumab联合使用的临床研究中，13%的患者由于免疫不良反应，特别是自身免疫性肝炎和急性肾损伤而停止治疗。在PD-1抗体单药治疗与联合治疗中，腹泻、皮疹、瘙痒和内分泌疾病(如甲状腺炎和胰腺炎)是最常见的毒性反应，在前期临床研究中未报告与治疗相关的死亡率。值得注意的是，Overman et al.12报告了63%的患者因为免疫不良反应而停止治疗，这表明发展免疫不良反应的患者可能仍然受益于免疫治疗药物，甚至可能比那些没有发展免疫不良反应的患者受益更多。虽然确切的机制尚不清楚，IRAEs可能是实体肿瘤包括胃肠道肿瘤预后的预测因子。未来，IRAEs应当根据其毒性等级及涉及器官以多学科的方式进行评估和管理。
2免疫检查点抑制剂在MSI-H/MMR-D型CRC中有效性评估的生物标志物
免疫检查点抑制剂靶向细胞内监管免疫和癌症细胞信号通路的相关基因，主要包括了PD-1, CTLA4及PD-L1。因而，这些分子的表达水平通常认为可作为免疫检查点抑制剂疗效预估的标志物。但是，目前对这一点依然存在争议，如用于检测PD-L1表达水平的方法目前还不统一。为了在大肠癌中寻找更合适的标志物，Le等人10对PD-L1高表达(定义为>5%)的MSI-H/ MMR-D肿瘤进行了分析。然而，作者发现，PD-L1在肿瘤中的表达并不能预测PD-L1表达水平高的患者的生存结果，瘤内CD8+淋巴细胞密度是更好的反应预后水平的指标。具有更高的瘤内CD8+淋巴细胞密度的患者，生存期更长。
除了MMR基因的体细胞突变外，与BRAF突变密切相关的MLH1高度甲基化导致的基因沉默也可能导致MSI-H/ MMR-D 型CRC的发生。为了研究MSI-H/MMR-D结直肠癌患者接受nivolumab治疗时BRAF突变的预测价值，Overman等发现，基于抗PD-1的治疗对有或无BRAF突变的患者都有益处，而PD-L1的表达水平对生存率的影响无统计学意义。KRAS突变或Lynch综合征是遗传性CRC最常见的原因，它的出现是MMR基因种系改变的结果。在nivolumab和ipilimumab联合治疗MSI-H/MMR-D型转移性结直肠癌患者的研究中，作者也分析了PD-L1的表达、KRAS和BRAF的突变以及Lynch综合征的状态，但没有发现临床反应与这些因素之间的相关性。然而，与其他患者相比，林奇综合症患者的ORR更高(分别为71%和48%)。值得注意的是，接受联合治疗的患者中约有20%、接受抗PD-1单药治疗的患者中有30%对治疗没有反应，并在治疗12周后发生疾病进展。尽管没有找到可以预测MSI-H/MMR-D 型CRC患者接受免疫检查点抑制剂治疗后受益情况的生物标志物，但最近的一项研究发现，相比于对免疫检查点抑制剂不应答的患者，从免疫检查点抑制剂中获益的患者通常有着更高的肿瘤突变负荷。在该研究中，作者使用基于液相捕获的下一代测序技术对22例MSI-H型 CRC患者进行了相对较小的队列研究，并进一步研究了更大的队列来证实这些发现。作者将他们的队列分为高和低肿瘤突变负担组，与低肿瘤负担患者相比，高肿瘤突变负担组获得了更大的PFS改善。在另一项研究免疫检查点抑制剂治疗生物标志物的临床研究中，使用NGS测序和nanostring检测了包括MSI-H/MMR-D型 CRC肿瘤在内的22种肿瘤类型的300多例患者，发现肿瘤突变负荷和T细胞表型是治疗反应的预测因子。值得注意的是，作者不仅使用Schrock报道的每外显子100个突变作为高TMB的指标，同时使用了37.4个突变/Mb进行了第二次分类，表明不同研究者在识别生物标志物的方法中存在异质性。其他有待进一步研究的潜在生物标志物包括TILs水平、肿瘤原发部位和转移部位、肿瘤体积以及其他免疫调节信号(如LAG3)的下调或过表达。因此，有必要开展更多的综合性研究，以进一步阐明这一日益增长的临床研究领域中的生物标志物。
3免疫检查点抑制剂的先天性耐药机制
3.1 MMR基因表达及MSI-H水平
与其他患者相比，MSI-H/MMR-D型CRC患者的淋巴结和远处器官转移更少。一项研究发现，在MSI-H/MMR-D患者中，TILs呈克罗恩病淋巴反应（大量离散的淋巴样聚集物）与较低的远处转移风险相关，提示免疫应答可能针对局部肿瘤微环境的癌细胞，从而抑制早期疾病的发生。因此， MSI-H/MMR-D 型CRC可能已经在整个转移过程中获得了一定程度的免疫回避能力（或是这些肿瘤可能只是免疫原性较低）。值得注意的是，尽管MMR基因表达的缺失是MSI-H表型的一个预测因子，但它可能并不总是意味着MSI-H表型，患者可能会出现与MSS肿瘤表型相似的MSI- L表型。一项关于MSI-H表型与Lynch综合征之间关系的研究表明，在所有癌症类型中，大约36%的Lynch综合征患者具有MSS表型，尽管这些患者大多数是非CRC患者(2例除外)。这一重要发现表明，MMR基因突变不一定导致MMR基因功能的丧失，或者MMR基因的丧失不一定是包括CRC在内的Lynch综合征患者癌变的驱动因素。因此，除了免疫组织化学染色外，新一代肿瘤图谱可以为进一步确定MSI-H状态提供重要信息。
3.2 影响免疫反应的基因改变
MSI-H/MMR-D型转移性结直肠癌患者免疫治疗固有/新生耐药的确切机制尚不清楚，但可能由宿主免疫系统及肿瘤生物学的多样性来解释（图1）。一项研究调查了179名来自肿瘤肿瘤基因组图谱(TCGA)的MSI-H/MMR-D型CRC患者的免疫逃避机制，研究者通过肿瘤样本的分子特征跟踪研究队列。作者发现了导致MSI-H/MMR-D型CRC患者免疫逃避的多种基因改变，这些改变主要发生在与免疫应答相关的基因中，而MSS CRCs患者主要发生在WNT信号中断的基因中。这些免疫应答基因的缺陷包括了β2M等位基因的缺失，MHC I类分子组件缺失，HLA分子中单个拷贝数缺失，最终表现为抗原呈递能力缺陷。此外，作者还发现了与免疫应答相关的基因的改变，这些基因涉及T细胞免疫应答、B细胞发育和NK细胞的功能。总的来说，该研究发现了许多潜在的机制，这些机制可能主要涉及免疫逃避和潜在的内在/从头开始的免疫检查点抑制剂耐药（表2）。
表2 研究新的耐药机制的临床前研究
图1 MSI-H结直肠癌(CRCs)免疫检查点抑制剂耐药的合理解释。突变的β2M和MHCI类分子导致抗原呈递过程中的异常，并改变JAK2和STAT磷酸化水平导致信号转导受到干扰。上调的 WNT和TGF-β信号导致Foxp3 + Treg细胞增加和抑制效应免疫信号
3.3 肿瘤代谢和免疫反应
一项蛋白质基因组研究分析了MSI-H/MMR-D型CRC样本的代谢，发现糖酵解和CD8+ T细胞浸润之间存在负相关，这表明低氧性肿瘤随着厌氧葡萄糖分解代谢的增加可能会产生过量的乳酸，而乳酸是CD8+ T细胞的负调节因子。这些数据表明，肿瘤代谢（也可能是肿瘤体积），可能对MSI-H/MMR-D型CRC患者免疫反应有重要影响。
克隆进化是通过T细胞受体基因重排和胸腺中细胞毒性T细胞的克隆选择而发生的，其目的是为了消除对自身组织产生免疫反应的克隆，同时使T细胞库产生多样性。对免疫检查点抑制剂(如阻断PD-1的检查点抑制剂)疗效的机制研究表明，这些药物对已存在肿瘤反应性效应T细胞和其他免疫系统元件(如T-helper (Th)细胞)的患者更有效。因此，在一组MSI-H/MMR-D型CRC患者中观察到的固有/新生耐药可能与细胞毒性T细胞库更有限以及缺乏预先存在的肿瘤抗原反应性T细胞有关。Foxp3+调节性T细胞(Treg)在免疫调节和细胞免疫功能方面的研究已取得了一定的进展，在癌症进展中的不良作用已在多项研究中报道。目前的证据表明，它们可以通过多种途径调节细胞毒性T淋巴细胞，起免疫抑制作用，主要包括激活TGF-β信号通路，及直接抑制细胞毒性T淋巴细胞。据报道，与MSI-H/MMR-D患者相比，MSS CRC患者肿瘤微环境中Foxp3+ Treg细胞更为丰富。肿瘤内调节性T细胞与细胞毒性T细胞的相对比例升高已被确定为多种实体肿瘤(包括CRC)的不良预后因素，表明瘤内Treg细胞可能是抑制免疫反应和推动癌症进展的重要决定因素。一项关于Foxp3+ Treg细胞在MSI-H/MMR-D患者中的作用的研究报道，Foxp3+ Treg细胞与CD8+细胞毒性T细胞一起存在于肿瘤微环境中，提示效应细胞与调节性T细胞之间可能存在动态平衡，影响免疫治疗的疗效。
3.5 髓系来源的抑制细胞
髓系来源的其他细胞群体在限制抗肿瘤免疫反应方面也有重要作用。例如，骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)限制有效的肿瘤免疫反应。越来越多的证据表明，MDSCs通过分泌可溶性酶和细胞因子介质，以及通过接触介导的T细胞活性抑制，削弱了实体肿瘤的免疫识别，促进了免疫逃避。进一步的研究可能决定这些负调控细胞是否可以纳入生物标记系统，如免疫评分，以更好地识别可能受益于检查点抑制剂的目标患者人群。
3.6 新抗原、免疫原性和突变负荷
众所周知，MSI-H/MMR-D型CRC患者由于MMR缺陷导致的移码突变而具有更高的肿瘤突变负荷。这些DNA序列的变化导致新抗原的形成，使MSI-H/MMR-D型CRC比MSS CRC更具免疫原性。这个现象提出了一个关于DNA突变结果的重要因素:数量与质量。移码突变导致蛋白的抗原结构的变化，是更有效地创建一个免疫反应；而点突变通常只导致蛋白质中单个氨基酸的变化，由于抗原结构的保存和缺乏免疫原性抗原表位，突变的蛋白可能无法产生强大的免疫反应。例如，KRAS点突变通常表现出非常有限的免疫原性活性，并导致癌变，这是多个实体肿瘤发展和进展的重要原因。值得注意的是，随着突变负荷的增加，免疫检查点抑制剂也被认为对肿瘤更有效。虽然突变负荷被认为是各种新抗原存在的替代物，但突变的数量可能与突变的质量没有直接关系，从而无法产生强大的T细胞反应。
4免疫检查点抑制剂的获得性耐药机制
虽然使用免疫检查点抑制剂治疗MSI-H/MMR-D型结直肠癌是一个相对较新的方案(少于5年的经验)，但已经观察到有患者对药物产生了耐药性。MSI导致的基因组不稳定性是一个持续的过程，导致在疾病的发展和进展过程中容易发生新的突变，其中一些突变可能导致免疫检查点抑制剂的获得性耐药。因而，获得性耐药发生的机制与内在的耐药有所不同。
4.1 Wnt信号通路
WNT /β-catenin通路在多个重要的细胞生命活动中发挥作用，包括调节干细胞更新分化，调控多条信号通路，影响下游抑癌基因的表达等。WNT /β-catenin信号也可能在肿瘤微环境中发挥重要的免疫调节作用。在小鼠黑色素瘤模型中进行的一项研究表明,激活WNT /β-catenin信号降低肿瘤微环境中T细胞的浸润水平,从而降低了免疫检查点抑制剂的效果。另一项研究表面，WNT /β-catenin信号通路还可以减少INF-γ的水平，从而抑制细胞毒性T细胞的功能。这些结果也与前述的研究一致，表明WNT信号通路可能损害机体对肿瘤的免疫识别，导致肿瘤细胞发生免疫逃避。
然而，值得注意的是，也有证据表明WNT信号可能会增强多功能CD8+记忆干细胞的产生和自我更新，这可能对产生和维持有效的抗肿瘤免疫反应相当重要。这些数据表明，WNT信号也可能在效应功能和成熟T细胞的存活中发挥有益的作用。因而，WNT信号的潜在影响应该在MSI-H/MMR-D型CRC患者中进行进一步研究。
4.2 TGF-β信号通路
TGF-β家族成员的细胞因子调节许多复杂的细胞生命活动,包括细胞周期控制和血管生成。除了对肿瘤细胞的直接调控作用，有研究报道,TGF-β家族细胞因子也可能对免疫系统有重要的影响，影响机体抗肿瘤免疫。例如,TGF-β可以诱导CD4 + Th细胞Foxp3基因表达上调，从而转化为Treg细胞。TGF-β也可能参与维持Foxp3 + Treg细胞的免疫抑制功能。在临床前研究中表明，TGF-β浓度的升高会导致效应T细胞的失活，从而降低细胞毒性T淋巴细胞在淋巴细胞中的比例。TGF-β也可能抑制穿孔素,granzyme A / B和Fas配体的表达，从而抵消效应细胞毒性T细胞的功能。也有研究表明，可以通过抑制TGF-β信号通路来逆转肿瘤介导的免疫抑制反应。然而，TGF-β在MSI-H/MMR-D型CRC患者免疫检查点抑制剂耐药中的作用还不明确，需要进一步的研究。
4.3 MHC I类分子
MHC I类分子在识别和提呈外来抗原以及癌细胞产生的新抗原方面起着至关重要的作用。针对MSI-H / MMR-D型CRC患者的一项研究表明,14个患者中有4人存在β2M的缺失，从而导致MHC I类分子功能受损。值得注意的是，β2M的突变通常发生在微卫星的编码区，因而β2M的缺失通常是MSI-H型肿瘤特有的。目前还不清楚，在免疫检查点抑制剂耐药过程中，具体是以下哪种因素导致了最终的耐药：抗原提呈发生缺陷；难以分化出针对新抗原的克隆；抗原提呈缺陷型细胞发生了进化等。除了CRC，在其他肿瘤如黑色素瘤中也发现了β2M的功能缺失。一项对一名对免疫治疗产生耐药性的黑色素瘤患者的调查分子分析也显示，在该患者的免疫细胞亚克隆中发现了MHC I类表达缺失。作者还报告一个独立β2M/ MHCI类分子突变导致功能障碍。在肺癌中也有报道称，MHC I类复合物和抗原肽转运蛋白(TAP1/TAP2)的缺失会导致抗原呈递缺陷。一项包含四个黑色素瘤患者的临床研究也进一步证实了，正是由于MHC I类分子的β2M突变，导致了PD-1抑制剂pembrolizumab的耐药。
4.4 JAK激酶
Janus激酶(JAK)也与免疫治疗的耐药性有关。这些蛋白是非受体酪氨酸激酶家族的成员，在肿瘤细胞中发挥促生长作用，同时通过多种机制调节免疫反应。JAK1/2的功能缺失型突变与黑素瘤患者对PD-1的获得性耐药有关。在Sucker等人的研究中发现，黑色素瘤患者中JAK2的突变,导致了IFN-γ的增加及后续抗PD-1治疗失败。挪威和英国的MSI-H/MMR-D型CRC患者的突变谱研究表明，JAK1纯合缺失可能与抗PD -1治疗的耐药性有关。然而，一项对使用nivolumab和ipilimumab治疗的MSI H/MMR-D型CRC患者的回顾性研究发现，4例患者存在JAK1功能缺失突变，但未出现耐药反应。综上所述，这些发现表明，相对于JAK1/2突变，JAK1/2双等位基因缺失可能是预测免疫治疗反应的更好的生物标志物。同时，JAK下游的STAT蛋白突变也可能导致IFN-γ信号受损，并抑制T细胞对癌细胞的杀伤作用。
4.5 T细胞功能的表观遗传学调控
在我们对T细胞衰竭机制的理解中，免疫检查点抑制剂失效的机制不断出现。特别是，人们高度重视表观遗传学的作用，特别是影响T细胞表型、功能的基因甲基化，可能还影响免疫检查点阻断反应的持久性。例如，Youngblood等报道，慢病毒感染可能导致PD-1位点去甲基化，导致T细胞衰竭和免疫反应提前终止。与这一发现一致的是，Ghoneim通过对抗原特异性小鼠CD8+ T细胞进行全基因组亚硫酸氢盐测序，确定了在PD-1被封锁期间进行的获得性从头甲基化过程，该过程导致了PD-1的甲基化水平较低，削弱了T细胞扩展能力和克隆多样性，从而导致获得性耐药。总的来说，这些数据表明PD-1启动子甲基化和其他表观遗传修饰可能是免疫检查点抑制剂失败的关键原因，但这些潜在的机制尚未在CRC中进行系统研究。单细胞分析技术的进步将使在CRC中研究T细胞表观遗传成为可能，并提供数据，以补充我们对MSI、MSS、其他突变和T细胞功能的表观遗传调控之间的了解。
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