学习专栏 | 提高细胞计数准确度的tips
许多生物科学包括单细胞测序技术的应用，都需要精准地测量细胞数量和存活率，然后再进行下游分析。可以采用传统的血球计数仪和显微镜进行手动评估或者采用自动细胞计数仪自动计数，不论选择何种细胞计数平台，对单一样本进行重复计数或计数多个样本时获得精准的计数值至关重要，但有时也面临诸多挑战。
单细胞测序技术（single cell sequencing）是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术，它能够弥补传统高通量测序的局限性，揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。因此过高或低估细胞浓度、小细胞或细胞碎片的残留、高结团率等因素都会对其下游实验结果有着关键影响。
本文针对10x单细胞测序平台列出了实现精准的细胞计数关键要素，以此为参照即可最大程度地降低差异，使细胞计数结果的可信度最大化。
一、样本室表面洁净
上样的样本室要擦拭干净，或细胞计数板要保持表面洁净。任何污染都可能导致不准确的结果。对于手动细胞计数，这涉及到移除和清洁盖玻片，并用70%的乙醇和水清洗计数室。当使用一次性塑料载玻片时，每个样品需要一个新的载玻片(如果载玻片有两个腔室，则需要一对样品)。
二、样本制备
如何制备目的细胞对手动和自动细胞计数的影响极大。应保持样本均匀性，方能确定计数差异是由实验处理还是样本制备条件引起的。
下面是样本制备的一些小技巧，可以提高您的计数准确度和精度。
标准化细胞操作步骤
在很多情况下，应比较来源于不同的培养瓶或培养板中的多个样本的细胞存活率和浓度。必须认识到细胞操作步骤的微小差异 (包括水解、移液或离心步骤) 会对不同样本的总细胞计数和存活率产生极大的影响。
确保细胞悬液混合均匀。
利用短暂且温和的涡旋振荡方法或手动搅拌试管——有时被称为“手指轻弹”技巧——可以制备均匀的悬液。将细胞置于实验台上放置一会然后移液，会导致细胞沉至管底，形成人为的浓度梯度，存在出错的可能性。细胞样本静置时间越长，浓度梯度越大，从而提高了差异性。为使移液差异最小化，应按照上述方法混合样本，然后从试管中间而不是试管底部 (底部可能形成人为的高浓度细胞)移液。
尽可能减少碎片。
不论选择何种计数或染色方法，含有大量碎片的样本都难以进行计数和存活率评估。碎片的数量因细胞类型、培养条件、制备方案和使用的试剂不同而异。考虑碎片可能的形成原因并采用措施尽可能地减少碎片，可以提升细细胞计数需要对整个原液的一个小样本进行分析，因此必须小心确保该样本是原始原液培养的代表。胞计数和存活率结果的准确性。
最大程度地减少细胞样本碎片的常见技巧：
在使用前离心台盼蓝
使用新鲜配制的染色试剂 (台盼蓝、NucBlue™ Live、碘化丙啶等)
使用经过过滤除菌的培养基和缓冲液
根据需要的时间间隔传代细胞
减少细胞结团
细胞计数需要对整个原液的一个小样本进行分析，因此必须小心确保该样本是原始原液培养的代表。虽然自动细胞计数仪能够应用算法来识别块内的细胞，但它们无法纠正非代表性样本。当手动计数时，团块的评分比单个细胞更具主观性，增加了用户与用户之间的可变性。细胞裂解后的细胞外DNA和细胞碎片是凝块形成的常见原因。细胞裂解可能是由于过度生长、通过过多的管道输送或冻融循环进行的机械剪切，以及胰蛋白酶消化不足或过度等因素造成的，这些因素也可能导致样本的不均匀。通过避免细胞裂解的原因和过滤细胞碎片样品，可以减少细胞团块。
三、正确调整聚焦
无论是手动计数还是依靠软件算法，重要的是要调整焦距和曝光设置，以确保单元格的最佳可见性，从而获得最精确的结果。最佳聚焦和曝光将显示细胞膜和背景之间的强烈对比。
A. 聚焦：在最佳聚焦下，活细胞的膜将在明亮的白色中心周围形成一个黑色的环；
B. 曝光：调整曝光，使强度最大，而不允许信号超出细胞边界。在调整过程中，可在亮场和荧光通道之间切换。在明场视野下，荧光信号的直径不应大于细胞边界。使用双荧光通道时，每个通道的曝光应单独设置。
四、适当调整参数与阈值
光强度
无论是台盼蓝或是荧光染色，都都必须使背景 (如噪声) 最小化同时使信号最大化，这样可以提高灵敏度并最大程度地提高信噪比。实现上述目标的要求之一是通过调整光源正确设置光强度。
细胞圆度、大小、亮度等
大多数自动细胞计数仪都包括可调整的参数设置，以最佳匹配研究中的细胞。例如，可以设置和保存细胞大小范围，以便从分析中排除碎片或其他细胞种群。也可以使用设置来定义细胞形状，可以在细胞计数之前或之后调整设置，并根据新的参数重新分析数据。
圆度：在大多数情况下，碎片的形状不规则，采用台酚蓝染色呈暗色，在许多自动细胞计数仪 (包括Countess II自动细胞计数仪) 中使用圆度参数可以将其高效“排除”。
大小：根据大小进行明场设门通常应用于有多种细胞类型的应用 (如神经和干细胞培养、血液样本或有碎片存在时)。使用自动细胞计数仪，用户可以轻松设门，在计数中包括或排除特定的细胞 (图6)。采用Countess II自动细胞计数仪，必须注意，用户可以针对活细胞和死细胞群体单独设门，从而提高了灵活性。
亮度：根据荧光强度设门提高了设门策略的灵活性。在许多情况下，用户只想知道多少细胞的信号模糊以及明亮，或者表达荧光蛋白。图7A显示了表达GFP的样本，包含两种细胞群体——信号模糊以及明亮；信号模糊的细胞被排除，13%的计数细胞表达较强的GFP。在图7B中，存在两种荧光颜色，可通过结果界面的“更多”(More) 按钮，根据大小、亮度、圆度和荧光强度单独设门。Countess II FL可以保存上述参数，以确保样本间的一致性，供以后使用。
五、总结
造成细胞计数结果差异的原因有很多种。样本制备、焦距设置、光强度设置和设门策略都会对结果产生影响。遵循这些提示将有助于提高细胞计数的准确性和再现性。
参考资料
1] 实现精准细胞计数的四个关键要素. Life
2] 191-Seven-Tips-to-Improve-Cell-Counting-Accuracy. Denovix