单细胞测序要不要混样？ | 单细胞专题

成功的实验设计应遵循三个原则：重复、随机分组和平衡区块设计（balanced block design）。常见的实验设计是分组后每个组别的单个样本分别提取核酸建库测序，在样本设计上严格遵守了生物学重复的设定（confounded design）。但此种实验设计中，由于实验分批进行会引入技术误差，可以将同组中不同样本混合后均匀分布在实验的各个阶段，减少了实验中技术误差的来源（balanced design）。

需要注意的一点是，balanced design这种实验设计的前提是每组样本中各个样本本身的特征属性类似，也就是说同组样本间个体差异很小，即使样本混合，也不会造成数据的偏离。当样本个体差异较大时，不适用于此方法，因为样本混合后数据难免受到偏离样本的影响，而且偏离样本的偏离程度越大，数据受影响程度越高，所以这种情况下实验设计需要采用confounded design，通过数据分析可以剔除偏离样本。

对于单细胞测序而言，常常需要先构建细胞图谱，在此基础上再开展后续各项分析，并且数据分析时以细胞聚类（cell cluster）为讨论对象，而不是像常规Bulk测序一样，以组别为分析对象，因此单细胞测序项目对样本入组要求没有Bulk测序那样严格，但是单细胞测序，特别是目的为图谱研究时，需要通过提高样本复杂度（增加样本数），尽可能全面的构建某一疾病类型、群体细胞图谱信息。因此，单细胞测序实验设计时首先需要保证生物学重复，不同样本来源的样本建议单独进行细胞解离和捕获、建库、测序，一般不需要考虑不同样本解离得到的细胞混合，再做细胞捕获，主要原因是单细胞测序项目需要保证捕获到足够的细胞数，单个样本分别捕获细胞时，后续分析除了整体分析以外，还可以做单样本分析，同时比较样本间细胞构成的差异，若样本混合后再捕获细胞，将无法分析样本差异；另外单细胞测序需要保证足够高的细胞捕获总数，如果不同样本来源的细胞混合后再进行捕获，单次捕获只能获得几千个混合样本细胞，，最后依然需要多次捕获才能得到足够多的细胞，无论是分析结果还是成本角度考虑，这种方式都没有优势（当然如果目标捕获细胞数不高，且细胞混合前已经按照样本进行了细胞标记的情况另论（例如CITE-seq））。

当然，在查阅资料时也会看到部分文章设计中，会将不同样本的细胞混合在一起再捕获，这些文章的共同点都是单个样本获得细胞数太少，无法达到捕获所需的细胞量，因此只能将同属性的样本混合，增加细胞起始量（图1,2）。

图1

图2

下表罗列了一些此类文献，如果老师课题设计涉及到混样，可以作为参考文献使用。

总结来说，单细胞测序需要有生物学重复，生物学重复间正常不建议混样，只有两种情况下可以考虑样本混合：1、单个样本获得的细胞数很少，需要样本混合才能得到足够的细胞数；2、能够通过外源细胞Barcode标记不同来源的细胞，此时可以做混样操作，此种方法可以在样本混合的基础上做样本间细胞构成差异分析。

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