NC：微生物组+转录组揭示炎症性皮肤病中的微生物-宿主相互作用 | 微生物专题

研究内容：特异性皮炎（atopic dermatitis，AD）和银屑病（psoriasis，PSO）的微生物-宿主相互作用

影响因子：11.878

发表年份：2019年8月

研究方法：16S rRNA基因测序、宏基因组测序、基因表达谱芯片

研究分组及样本数量：中度至重度慢性AD组（91名）、斑块型PSO成年患者（134名）、健康志愿者（126名）

样本类型：皮肤拭子、皮肤组织

实验背景

皮肤代表一个主要的组织界面，微生物种群和表面下组织的接触为研究在引发和维持特应性/过敏性或自身免疫性炎症过程中宿主与微生物的相互作用提供了独特的机会。共生或致病性微生物与它们所定植的宿主之间的相互作用是维持体内平衡和引发疾病的关键，共生皮肤微生物通过与抗原呈递树突状细胞（DC）和效应T细胞群的特定亚群相互作用来维持适应性皮肤免疫稳态，支持自身生存，并防止病原体的过度生长。目前，关于对不同微生物种类与炎症性皮肤病的关联及其对宿主基因组的影响的研究报道较少。

特应性皮炎（AD）是一种特应性/过敏性炎症疾病的模型，其共生皮肤微生物与疾病发作有关。AD相关的生态失调通常以金黄色葡萄球菌的定植和同时丧失其他潜在的有益物种为特征。金黄色葡萄球菌能有效地在皮肤上定植，并表达几种毒力因子，通过对细胞和动物模型的研究，证实其在AD的发病机制中发挥作用。金黄色葡萄球菌与疾病的严重程度有关，一方面可能是金黄色葡萄球菌的有害影响，另一方面是皮肤微生物群的其它成员丧失有益影响的综合结果。因此，使用针对金黄色葡萄球菌的抗菌疗法可能不是最佳选择，因为它们也可能消灭有益的物种或菌株，并打破皮肤与其微生物群之间的互惠互动。

银屑病（PSO）似乎在病变部位诱发了生理变化，进而选择了一种特定的微生物群。银屑病（PSO）相关皮肤微生物群显示出了疾病特异性的特征，可能具有诊断价值，但差异微生物群是否具有病理生理意义尚不确定。

本研究中，作者对健康志愿者（HV）、AD和PSO患者皮肤中的微生物组和微生物组相关宿主的转录本进行了大规模的综合分析，揭示了慢性皮肤炎症中宿主-微生物相互作用的两种不同模式。

实验设计

1.样本分组

中度至重度慢性AD组：n=91

斑块型PSO组：n=134

健康志愿者：n=126

2.检测方法

采用16S rRNA基因测序和宏基因组对皮肤微生物组进行检测，采用基因表达谱芯片对相应的皮肤组织进行转录组检测。

实验结果

1.AD和PS的皮肤微生物群具有高度的差异性

使用标准化的方法收集皮肤拭子，利用QIIME v1.8.018对336万个16S rRNA基因reads进行了分析，在99.3%的同源性水平上鉴定到了17,725个操作分类单元（OTU）。去除稀有OTUs后，仍有3,342个。与Greengenes 16S rRNA基因数据库进行序列比对，显示健康的皮肤微生物群与先前的报道一致。总体分析表明AD和HV之间的微生物群落存在明显差异（图1a，b），同时通过对95个最丰富OTU的非度量多维尺度分析（NMDS）分析证实了这一结论。此外，AD多样性降低，共有51个高丰度OTU在HV、AD和PSO之间有显著差异（图1a）。

图1 AD和PSO患者皮肤微生物群的特征

此外，作者还仔细分析了年龄、解剖位置、性别和临床中心等混杂因素的影响。校正混杂效应后，17例AD患者中有8例出现混杂OTU，13例PSO患者中有5例出现混杂OTU。例如克氏乳杆菌与年龄有关、金黄色葡萄球菌与取样部位有关、乳酸菌与性别有关，但矫正后均与疾病显著相关（p<0.01）。相关性计算分别使用的是Spearman（年龄）、Kruskal-Wallis（取样部位和机构）、Mann-Whitney U（性别）。其余11个最显著的OTU如图1c所示。最显著的结果是AD中金黄色葡萄球菌的丰度增加，而AD中严格厌氧菌的OTU丰度显著降低。对缺乏金黄色葡萄球菌的样品的重复分析表明AD中厌氧菌的缺失不是由金黄色葡萄球菌引起的（如图1d）。与HV相比，PSO的显著变化包括C.simulans和C.kroppenstedtii以及Finegoldia和Neisseriae物种的丰度增加。与健康皮肤相比，AD和PSO中乳酸杆菌、伯克霍尔德菌和痤疮杆菌的丰度均较低。

2. 基于微生物群的AD和PSO分类

为了确定皮肤微生物群是否能区分炎症性皮肤病理，作者采用有监督学习pipeline构建分类器，探索微生物类群的关键集合。作者鉴定出26种区分AD和HV队列的微生物，曲线下面积（AUC）为0.94（class errors HV=0.03，AD=0.27，图2a）。最具鉴别能力的分类群是葡萄球菌属，包括金黄色葡萄球菌（Z=14.0）、表皮葡萄球菌（Z=5.8）、葡萄球菌属（Z=-6.9）和伯克霍尔德菌属（Z=-7.5）。NMDS分析强调了金黄色葡萄球菌在区分AD和HV中的作用。作者鉴定了24种区分PSO和HV的微生物，AUC为0.85（class errors HV=0.09，PSO=0.33，图2b）。最具鉴别能力的微生物是：模拟梭菌（Z=15.5）、奈瑟菌科（Z=6.9）、克氏梭菌（Z=5.5）、乳酸杆菌属（Z=-8.4）和乳酸杆菌属（Z=-3.5）。NMDS分析表明HV和PSO之间存在明显的分离边界。作者鉴定出15种区分AD和PSO的微生物，AUC为0.86（class errors AD=0.29，PSO=0.13）。最高的微生物是金黄色葡萄球菌（Z=14.0）、表皮葡萄球菌（Z=3.9）、金黄葡萄球菌（Z=-6.5）、拟青霉（Z=-5.0）和克氏葡萄球菌（Z=-4.4）。NMDS分析强调了金黄色葡萄球菌在AD中的重要性。

图2 AD和PSO患者的微生物分类

3. 微生物群落与AD或PSO相关

为了解不同疾病状态下微生物群落间的相互作用，作者采用了网络原理来表达共生关系。作者发现AD和PSO相关微生物群落结构存在差异。对于与AD相关的微生物，Sparcc分类群之间的相关性结果显示有19个物种的相关性高于阈值0.2（p<0.05，图2c）。金黄色葡萄球菌与包括棒状杆菌属、表皮葡萄球菌属、铁皮单胞菌属和叶状杆菌属在内的24种对PSO分类有重要意义的微生物呈负相关（图2b），其中16种呈显著的SparCC相关（Sparcc>0.2，p<0.05，图2d）。最具鉴别力的分类群有：拟青冈与克氏青冈分别与链球菌属、厌氧链球菌属、厌氧链球菌属、奈瑟氏菌科、罗氏菌属呈显著正相关关系。作者从PSO中微生物相互作用的比较结果发现，与该疾病类型相关物种有多个，而不是像AD中那样由单一物种控制微生物表观。

4. AD和PSO转录组的重叠和区别

全层皮肤活检的转录本基于严格的10-5FDR水平和1.5倍或更高的差异倍数（FCH）来定义。主成分分析（PCA）揭示了HV、AD和PSO之间的明显分离（图3a）。差异基因表达分析鉴定到AD和HV共有1232个基因，以及PSO和HV之间共有2525个基因，以及AD和PSO之间共有1051个基因（图3b）。

为了深入了解疾病特异性基因的功能，作者进行了IPA分析，揭示了在AD中辅助性T细胞中的Th2和Th1信号、树突状细胞成熟和iCOS-iCOSL信号以及干扰素信号、LPS-IL-1介导的RXR功能抑制信号都显著过度表达，PSO中的炎症通路和Th17信号转导也显著过表达。干扰素信号和p38 MAPK信号水平区分PSO和AD（图3c）。

TNF和IFNG被认为是AD和PSO的上游调节因子，而IL4和IL13则是AD的独特特征，支持了TH2相关信号在AD中的中心作用。GO富集分析强调了AD的趋化性、炎症反应和细胞外基质组织，以及AD和PSO中白细胞的激活。在AD和PSO的上调基因中，作者观察到了炎症介质（S100蛋白、防御素、基质金属蛋白酶、IL-1家族细胞因子）、T辅助相关基因（CCL1、CCL18、IL17A、IL22、PI3/Elafin）、屏障基因（KRT16、SERPINB4、KLK9、FLG2、LCE5A、CLDN8）和色氨酸代谢相关基因（KYNU）。下调基因包括IL34、抗炎IL37和NOS2（图3d）。

图3 AD和PSO患者皮肤转录组

5. 金黄色葡萄球菌诱导的AD宿主基因特征

基于微生物组和转录组数据集，作者讨论了宿主和微生物之间的相互作用。作者根据微生物丰度将AD样品分为“高”和“低”两组，包括分析中的顶部（n=27）和底部（n=25）部分。低丰度样品中不含金黄色葡萄球菌，而高丰度样品在所有情况下均显示金黄色葡萄球菌的高丰度（87-99%）。

首先，作者探索了金黄色葡萄球菌高、低群的微生物基因库，利用PICRUST功能预测软件基于16S rRNA基因标记进行功能预测，金黄色葡萄球菌的高丰度组与低丰度组相比，出现了细菌毒素、双组分系统和糖酵解的富集。大多数功能是由金黄色葡萄球菌OTUs贡献的。为了验证基于OTU的预测，作者对一些样本进行了全基因组测序（WGS），显示了两种独立测序方法之间的紧密一致性。WGS数据证实了金黄色葡萄球菌高样本中主要是细菌毒素hld和plc（分别为α和δ毒素）以及与半乳糖代谢、磷酸转移酶系统、双组分系统、糖酵解和糖异生相关的基因的富集。

接下来，作者研究了皮肤的基因表达谱。比较含有高丰度和低丰度金黄色葡萄球菌的皮肤样本的转录组，发现了一组256个显著差异的基因（FDR<0.05，FCH≥1.5）。为了探讨金黄色葡萄球菌调控基因是否与AD病理生理学的整体特征相关，作者使用所有显著的AD相关基因，建立了一个基于成对Pearson相关（r>0.7）的共表达网络。使用网络社区发现算法（Network community detection）鉴定出十个不同的模块，丰富了疾病相关功能（图4a）。将金黄色葡萄球菌调控的基因投射到AD网络上，发现与角质形成细胞分化和细胞外基质组织相关的M1和M5模块（超几何检验，FDR<0.05）基因显著富集（图4b）。

使用GO和IPA对金黄色葡萄球菌调控基因的功能分析显示，角化和皮肤发育（图4c）以及TH17信号和色氨酸（trp）降解分别富集。IPA预测IL1B、TNF和IFNG作为上游调节因子（图4d），白细胞迁移和上皮组织发育作为下游效应（图4e）。当上调基因为炎症信号而富集时，下调基因主要为皮肤发育而过度表达。TOP基因包括皮肤屏障和抗菌因子（S100A7、DEFB4A/B、S100A9、MMP12、FLG2、CLDN8、ADAM12）、trp代谢成分（KYNU、TDO2、KMO）、免疫激活（IL1B、CCL2、CCL19）和Th2信号（IL4R、IL5、IL13、PI3、TNFRSF4、CCR4）。此外，HIF1A及其靶基因HK2和PFKP都是受显著调控的基因（图4e，f）。

由于在金黄色葡萄球菌高丰度样本中富集了络氨酸途径，作者对trp分解进行了转录重建，表明皮肤中积聚了3-羟基蒽醌酸（3-HAA）。此外，作者还研究了金黄色葡萄球菌的AD相关菌株在多大程度上依赖于trp，并从重度AD患者中分离出32种金黄色葡萄球菌菌株。作者发现66%的分离菌株独立于trp生长，作者的WGS数据进一步支持了这一结果（金黄色葡萄球菌高丰度样本中有73%的trp生物合成相关基因）。

最后，为了探讨金黄色葡萄球菌对本研究确定的基因靶点的影响，将具有器官型的人表皮等效物局部暴露于106CFU金黄色葡萄球菌24小时，然后用qPCR测量基因表达。金黄色葡萄球菌显著诱导DEFB4、PI3、IL4R和S100A9的表达。

图4 金黄色葡萄球菌特征以及功能关联

6.PSO微生物组和转录组的整合分析

接下来，作者将PSO微生物组与相关的皮肤转录组结合起来。检测PSO中最有辨别力的微生物在划分皮肤转录组方面的能力，并没有产生显著的结果。因此，作者构建了一个基于PSO差异表达基因的共表达网络，并将其分成12个模块。作者使用MaAsLin软件包中实现的线性模型确定了PSO和HV之间的前25个差异最丰富的分类群与PSO共表达的模块特征基因之间的关联网络。每个微生物模块的特征基因对都适用于控制身体部位、机构、年龄和性别影响的线性模型。总的来说，确定了六个关联（FDR<0.20）。棒状杆菌与3个共表达模块M2、M3和M10呈负相关。M3与细胞周期密切相关，而M2和M10富含炎症途径，包括干扰素信号Th1和Th2激活。这些结果表明棒状杆菌可能在疾病中起到调节作用，但在疾病中这种调节作用降低了。总的来说，作者的结果表明PSO中的微生物-宿主关联比AD中观察到的要差得多。

7. AD中的微生物组与临床严重程度有关

为研究微生物群及基因表达对临床的影响严重程度，作者结合多元回归进行特征选择。根据基因和微生物与SCORAD或PASI指数的相关性对它们进行排序，然后对回归模型进行前N个特征的训练（N=5-50，以5为增量），并选择表现最好的模型。使用随机森林回归分析得到的Top35个物种的丰度预测SCORAD是理想的。准确度相对较低（MAE=12.35，相关性真值与预测值之比=0.55），表明微生物丰度和临床严重程度的变化可能由其他因素解释。其中相关性最高的物种是铁皮单胞菌属、痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌。除金黄色葡萄球菌外，大多数所选物种呈负相关，表明微生物多样性可能与AD的临床严重程度呈负相关。与SCORAD的多样性相关性弱但具有显著性（cor=-0.27，p=0.01）。

转录组学数据在预测SCORAD方面优于微生物丰度。top模型使用线性回归法确定了15个基因作为最佳预测基因集（MAE=9.84，相关性真值与预测值之比=0.66）。top基因包括SEMA3D、IGSF10、LGR5和CASP10。PSO的临床严重程度与微生物丰度之间没有相关性。最后，表明感染的AD病变中渗出和结痂与金黄色葡萄球菌的丰度显著相关，支持金黄色葡萄球菌定植与AD临床严重程度之间的联系。

实验小结

图5 特应性皮炎和银屑病中宿主与微生物的相互作用

尽管关于皮肤内环境平衡中微生物多样性方面的报道较多，但对炎症性疾病中微生物失调的相关性却知之甚少。作者对特应性皮炎或银屑病患者的皮肤微生物群落与皮肤基因表达的整体模式进行了比较分析。皮肤微生物群通过16S扩增子或全基因组测序（宏基因组测序）进行分析，皮肤转录组通过微阵列芯片进行分析，然后整合数据。作者发现，特应性皮炎和银屑病可按不同的微生物进行分类，这与健康志愿者的微生物组分不同。特应性皮炎主要由单一微生物（金黄色葡萄球菌）控制，并与一种与疾病相关的宿主转录特征相关，该特征丰富了皮肤屏障功能、色氨酸代谢和免疫激活。与之相反，银屑病的特征是微生物群落共存，与疾病相关基因表达的相关性较弱。本研究为皮肤失调的生物标记物发现和靶向治疗提供了基础。

编者有话说特异性皮炎和银屑病这两种不易区分的疾病，鲜有讨论两种情况下皮肤上不同的微生物群落组成和特征。在这项研究中，作者将微生物组（16S测序+宏基因组测序）和转录组（基因表达谱芯片或转录组测）结合，不仅探究了两种炎症性皮肤病与微生物的相关性，还探究了微生物组相关宿主的转录组，并且进一步将两个组学的数据整合分析，为皮肤失调的生物标记物发现和靶向治疗提供了研究基础和新视角。

相关阅读肠道菌群通过”肠脑轴”介导间歇性禁食减轻糖尿病引起的认知障碍 | 微生物专题
微生物组+转录组联合研究揭示治疗艰难梭菌感染的新机制 | 微生物专题
微生物16S测序数据的正确打开方式5分+文章就这么简单 | 微生物专题
宏基因组+宏蛋白质组揭示糖尿病发生中的肠道菌群变化 | 微生物专题