用户文章：DNA甲基化影响乳腺炎奶牛基因与miRNA调控 | DNA甲基化专题

标题：Genome-wide methylation and transcriptome of blood neutrophils reveal the roles of DNA methylation in affecting transcription of protein-coding genes and miRNAs in E. coli-infected mastitis cows

期刊：BMC Genomics

IF：3.594

联川提供：RRBS+RNA-seq测序分析

DOI：10.1186/s12864-020-6526-z

前面内容中我们说到，RRBS (Reduce Representation Bisulfite Sequencing)是最具高性价比的DNA甲基化检测方案。具有单碱基分辨率；全基因组范围检测，富集启动子/CpG岛甲基化调控区域；测序数据量远低于WGBS，经济实惠等优点。广泛用于人、哺乳动物及鱼类方向的高水平甲基化研究，是DNA甲基化检测金标准方案之一。乳腺炎是奶牛产业中最为普遍的疾病之一，对奶牛健康和牧场经济效益产生巨大影响。中性粒细胞是由乳腺炎感染引发的炎症反应的首个效应物，并且是抵抗大肠杆菌（E. coli）的重要防御细胞。DNA甲基化作为调节基因功能的重要表观遗传机制，与牛乳腺炎有关。山东省农业科学院奶牛研究中心杨春红及其团队成员在BMC Genomics上发表了相关文章并阐释了其中的关联。
一张图带你看懂本文的研究思路：

说明：外周血中性粒细胞RRBS+RNA-seq测序，找出两组学共有与乳腺炎症相关基因并进行验证（类似RNA-seq做qPCR，BSP验证DMR也是机制研究中必不可少的环节！！！）

RRBS+RNA-seq测序分析服务由联川提供。

结果

1. 实验材料的鉴定和分析

首先，研究人员进行了实验材料的鉴定和分析，这里主要是进行材料的筛选（牛奶SCC，血液学分析和细菌鉴定），从52份材料中筛选出6份半同胞健康奶牛（HC）和大肠杆菌侵染的乳腺炎奶牛（MC）。结果显示，MC组奶牛的平均血液中性粒细胞计数和SCC计数均显著高于HC组，研究者继而从牛奶样品中分离培养细菌，进行16S rDNA测序，所述细菌感染被鉴定为大肠杆菌。

三个健康的和三个大肠杆菌感染的乳腺炎奶牛样品的基本信息。a 6个样本中牛奶体细胞计数和血液中性粒细胞计数结果。b六个奶牛样品的细菌鉴定结果。

2. 牛血液中性粒细胞的DNA甲基化测序

RRBS测序结果表明，受大肠杆菌感染的乳腺炎奶牛的DNA甲基化水平低于健康奶牛（下左图），且不同的基因区域内甲基化水平不同，启动子和外显子区域甲基化水平较高（下右图）。根据P  <0.05，共筛选出494个位于356基因上的DMRs，其中，61个上调，433个下调（MC vs. HC）。并对这些基因进行GO和KEGG功能分析，PPI分析（蛋白互作网络分析）和QTL定位，进一步筛选与免疫，防御，和炎症反应相关基因。

左图：染色体水平上的三个HC样品（外部三个圆圈）和三个MC样品（内部三个圆圈）的总体DNA甲基化圈图。

右图：6头奶牛样品中不同基因组区域的DNA甲基化水平分布。x轴表示不同的基因区域，y轴表示特定基因区域上差异甲基化基因的甲基化水平。

3. 差异表达基因（DEGs）筛选

通过RNA-seq筛选DEGs，以log2 FC ≥1 and P < 0.05为阈值，共筛选出1339个DEGs，其中1094 个上调，245 个下调。同样进行GO，KEGG，PPI和QTL定位，找出候选基因。

4. 甲基化和转录组数据之间的关联分析

万物皆可连，多组学关联分析已成为生物信息时代数据挖掘的重要手段之一。基因启动子区域的甲基化水平通常与基因的表达呈负相关，故作者计算了二者的相关性（Pearson），并得出一致结论。此外，通过整合两组学数据，找出29个共有差异表达的甲基化基因，其中，7个基因与免疫和炎症反应相关，例如，SLC40A1，CITED2和LGR4，并作为候选。

奶牛中性粒细胞基因甲基化和表达水平的热图分析

5. 候选蛋白质编码基因和miRNA的验证

为了通过BSP和qPCR验证进一步证实转录组和甲基组学结果的可靠性，选择启动子区域甲基化程度低且表达水平高的CITED2和SLC40A1基因作为候选基因进行分析。甲基化和表达水平验证实验表明CITED2和SLC40A1大肠杆菌感染后表达水平升高，甲基化水平降低。这些结果与高通量测序的结果一致。

健康奶牛和乳腺炎奶牛中性粒细胞中CITED2和SLC40A1基因的甲基化和表达水平。

注：在（a和b）中，每一行代表一个克隆，每一列代表一个CG位点。空心和实心圆分别表示未甲基化和甲基化的CpG。

除此之外，作者还做了LGR4基因的可变剪切分析和bta-miR-15a甲基化与靶基因CD163表达水平的分析。LGR4外显子5 的甲基化调节其自身的可变剪接，bta-miR-15a启动子的甲基化对其靶基因CD163的表达具有间接影响，这些都与甲基化水平相关，具体方法不再赘述。

结论

这项研究探索了DNA甲基化在大肠杆菌诱导的乳腺炎中影响蛋白质编码基因和miRNA转录的作用，从而解释了DNA甲基化在乳腺炎发病机理中的功能，并为奶牛乳腺炎抗性提供了新的靶标和表观遗传标记。

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