系统评估不同解离方法、细胞保存方式对scRNA和snRNA数据结果的影响|单细胞专题

题目：Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows

发表期刊：Genome Biology

关键词：热解离、冷解离、冷冻保存、甲醇固定、scRNA、snRNA、免疫细胞、上皮细胞

影响因子：10.806

发表时间：2020.06

结论先导

1.大多数人类癌症的来源是上皮细胞，冷冻保存样本中上皮细胞类型出现耗竭，建议肿瘤样本谨慎选择冷冻保存方式；

2.snRNA-seq数据中T、B和NK细胞的比例不足对肿瘤免疫学、肿瘤免疫治疗和自身免疫性疾病研究的课题设计具有重要参考意义，不推荐选择 snRNA-seq 方法研究免疫细胞相关的疾病。

1研究背景

单细胞转录组测序(scRNA-seq)是一项日益强大的技术，能够分析单个细胞中的基因表达。近年来，scRNA-seq被广泛应用于生物发育、正常组织、癌症和其他疾病的研究利用scRNA-seq揭示了组织的异质性，并提供了以前无法了解到的组织功能和细胞功能。

图1

如图1，单细胞测序的主要流程包括如下几个步骤：

1.从感兴趣的器官或组织分离活单细胞。此步骤需要摸索和调整消化方案，以最大限度地增加细胞数量和细胞质量，同时减少细胞死亡；也可以分离并培养原代细胞并制备成单细胞；

2.选择合适的单细胞捕获方法捕获制备的细胞

3.对单细胞RNA进行逆转录，然后对得到的cDNA进行PCR扩增和文库制备

4.进行二代测序，获得测序数据

5.测序数据与参考基因组比对，进行质量控制，然后进行分析

以上流程中，最重要最关键的一个步骤就是单细胞悬液制备，因为细胞悬液的质量与最后的数据质量息息相关，与此同时，此步骤也是最难的一步，其中艰辛，凡是做过单细胞实验的小伙伴都知道。实体组织需要解离后获得高质量细胞悬液，最佳的解离需要在释放难以解离的细胞类型和避免伤害脆弱细胞之间取得平衡。组织分离最常用的方法是酶解法，根据组织类型的不同，需要使用不同酶种类及浓度组合在37℃下孵育不同时间。在这个温度下，细胞转录活跃，因此解离过程基因表达可能会发生改变。最小化这种影响的替代方法是使用冷活性蛋白酶，在冰上进行组织解离。另外，单核RNA测序 (snRNA-seq)可以利用冷冻组织组织解离释放细胞核，从而避免了许多解离诱导的影响，同时单细胞核测序也可以解决大直径细胞无法直接进行scRNA-seq的困扰。另外在实际操作中，往往面临着不能立即处理标本的情况，需要将样本以组织组织或单细胞悬液的形式保存（甲醇固定和冷藏保存）。

以上不同样本处理方法都会引入了特定的偏差和影响，因此在设计和分析单细胞实验数据时，需要考虑到这些影响。然而，现在我们仍然不能完全理解不同样本处理方法的影响，因此研究人员使用健康成年小鼠肾脏进行了一项综合研究：使用10x Genomics 开展scRNA-seq和snRNA-seq，同时开展了未解离和解离组织的常规RNA-seq。单细胞测序比较了两个组织解离方法(37℃解离，称为热解离, 冷活性蛋白酶冰上解离，称为冷解离)、两种单细胞悬液保存方法(甲醇固定和冷冻保存)和三个单细胞核制备方法间的数据差异。此次实验共获得了77656 个单细胞转录组数据、 98303个单细胞核转录组数据和15个Bulk RNA-seq数据。

2样本处理

每个实验使用了来自三只不同成年雄性C57BL/6J小鼠的三个肾脏

热解离：37℃下使用美天旎Multi-tissue dissociation kit 2进行组织解离

冷解离：冷活性蛋白酶（地衣芽孢杆菌）在冰上进行组织冷解离

细胞核分离：

荧光激活细胞核分选（FANS）方法1：清洗细胞核三次， 离心速度500g（SN_FANS_3x500g）；

荧光激活细胞核分选（FANS）方法2：清洗细胞核一次，离心速度2000g（SN_FANS_1x2000g）

方法3（sucrose gradient）：细胞核先500g自旋清洗，然后使用蔗糖缓冲液清洗

甲醇固定细胞：组织解离后，细胞以1000g离心10分钟，浓缩至约5*106 cells/mL，取200ul细胞悬液等分装入置于冰上的2 mL冷冻管中，800ul 100%甲醇（-20℃冷冻）逐滴加入到样本中并轻轻搅动细胞以防止结块，冻存管在- 20℃保存30分钟，然后直接转移到- 80℃

低温保存细胞：组织解离后，细胞以400g离心10 min（重复试验离心条件为4℃ 1200g离心5min），然后重悬在冷冻液中（50%胎牛血清、40% rpi -1640、10% DMSO）,调整细胞浓度至1*106 cells/mL。取1mL细胞悬浮液放入2mL的冻存管中，然后放入异丙醇冻存盒，-80过夜，第二天转移到液氮储存。

图2

3实验结果热解离VS冷解离

热解离会引起应激反应

解离后得到的细胞悬液做Bulk RNA-seq，在热解离样本中鉴定到71个上调基因，在冷解离样本中鉴定到5个上调基因。GO富集分析发现热解离样本的高表达基因显著富集到细胞死亡的调控，差异倍数最大的基因（log2FC>4）包括即时早期反应基因（IEGs ，Immediate-Early Response Genes ）Fosb、Fos、Jun、Junb、Atf3、Egr1和热休克蛋白Hspa1a、Hspa1b（图3A），这些数据证实了Adam等人的结论，即热解离组织会导致应激反应相关基因的变化。

单细胞测序揭示了不同细胞群体的异质应激反应

使用新鲜细胞悬浮液的scRNA-seq图谱分析了两种组织分离方案之间的差异。数据包含23108个细胞，其中11,851个细胞来自冷解离，11,257个细胞来自热解离，共鉴定到15中细胞类型（图3B）。

差异分析发现，热解离样本有64个基因在至少一种细胞类型中高表达（图3B），显著富集的GO是细胞死亡的调控，细胞中最常见的过表达基因包括即时早期反应基因，如Junb和Jund(在7种细胞类型中差异表达)以及Jun和Fos(在5种细胞类型中差异表达)（图3D）。

值得注意的是，不同细胞类型的差异表达基因的数量有所不同(图3B)，这表明细胞类型对热解离反应不同。选择17个已知的热解离诱导基因(Fosb, Fos, Jun, Junb, Jund, Atf3, Egr1, Hspa1a, Hspa1b, Hsp90ab1, Hspa8, Hspb1, Ier3, Ier2, Btg1, Btg2, Dusp1) 用于计算压力得分，在14种细胞类型中，有8种细胞类型的检测到显著的高压力分数（图3C）。这些结果强调了某些细胞类型，如免疫细胞和内皮细胞，对热解离特别敏感。

冷解离样本中，有20个基因的高表达，其中只有5个基因(Hbb-bs、Hba-a1 Hba-a2, mt-Co1, Malat1)被确定在至少两个细胞类型中高表达（图3B），另外发现，冷解离处理样本中存留血红蛋白转录本的污染比例更高。

图3

两种组织分离方案的细胞组成不同

除了基因表达变化之外，分析还鉴定了8个细胞群在热解离样本中含量变少，包括足细胞、系膜细胞和内皮细胞(图4)。这些衰竭细胞类型还显示出上述应激反应相关基因的显著高表达。值得注意的是，在热解离样本中只检测到3个足细胞(占总细胞的0.03%)，冷解离样本中足细胞数为330 (2.78%)。这些发现表明，某些细胞类型对热解离很敏感。

而在冷解离样本中，肾脏髓袢升支(aLOH)和近端小管(PT)细胞冷解离样本中数量变少(aLOH：4.99% vs. 2.52%、 PT：71.36% vs. 63.34% ) (图4)，这表明这些细胞被冷活性蛋白酶解离出的效率较低

图4

冰冻保存VS甲醇固定

低温保存会消耗上皮细胞类型

肾脏中细胞最多的细胞类型是近端小管(PT)，两种细胞保存方法中，PT恢复率差异最显著。在新鲜细胞悬液中，PT在冷解离和热解离样品中分别占63.12%和70.86%。相比之下，PT在低温保存的样品中几乎检测不到，分别为0.31%和0.57%（图5A）。比较其他细胞类型在新鲜样本和冷冻保存样本中的恢复率，发现在冷解离后低温保存的样品中，五种肾细胞类型的细胞数量明显不足，其中三种细胞在热处理后低温保存的样品中也不足。结合冷冻保存样本中PT细胞的丢失，这表明低温保存和随后的解冻方案未能有效恢复肾上皮细胞数量，

由于之前有文献报道冷冻保存细胞和新鲜细胞的数据类似，因此作者又做了几个重复试验：使用不同的小鼠（雌性-VS-雄性）、不同的10X试剂（V3-VS-V2）、不同储存时间（2周-VS-6周）、不同复苏和重悬离心力（1200g-VS-400g），发现冷冻保存细胞种PT细胞数量显著减少，在第一次和重复实验中，分别只有约33%和32%的细胞在冷冻保存后被恢复，由此得出结论，至少在小鼠肾脏中，使用50%胎牛血清、40% RPMI和10% DMSO冷冻保存分离细胞可导致细胞成分的重大缺失。

在小鼠肾脏解离样本中，甲醇固定比低温保存更好的再现细胞类型组成。与新鲜解离的样本相比，在甲醇固定的样本中，某些细胞类型的细胞数量略有不足，其中巨噬细胞减少最多，冷解离的样本中由5.36减少到3.2%，在热解离的样本中由4.28减少到2.54%（图5A）。

图5

低温保存诱导压力应答

在冷解离的样品中，与新鲜细胞悬浮液相比，在低温保存和甲醇固定的细胞中，分别有31个和27个基因在至少一种细胞类型中过表达（图5B）。在低温贮藏样本中,压力应答基因被诱导,包括多个即早期反应基因和热休克蛋白（图5C）。相比之下,甲醇固定细胞高表达为小管细胞基因和血红蛋白基因，在不同的细胞类型中检测到相同的转录本集，表明甲醇固定损伤细胞，导致环境RNA污染（图5D）。

单细胞VS单细胞核

确定了冷活性蛋白酶作为一种对sc-RNA损伤较小的组织分离方法，接下来将其与snRNA-seq进行比较。使用Balb/c雄性小鼠的肾脏(10x v2试剂)或雌性小鼠的肾脏(使用v3化学方法)，并使用低温组织分离制备细胞用于scRNA-seq，使用三种不同的snRNA-seq方法制备细胞核（图2）。三种细胞核分离方案间最显著的差异是SN_FANS_ 1x2000g的线粒体基因污染更高，单核测序每个细胞核检测到的基因比单细胞测序每个细胞检测到的基因多，中位数分别为1819和981个基因。

非上皮性肾细胞类型的检出率在scRNA-seq和snRNA-seq文库中有显著差异，在所有实验中，snRNA-seq的免疫细胞检测率(平均0.73%)低于scRNA-seq的(平均6.03%)。完整肾脏的bulk RNA-seq（图2）预测Balb/c雌性小鼠肾脏中约有1.51%的免疫细胞，Balb/c雄性小鼠中约有4.84%的免疫细胞，这表明在snRNA-seq数据中免疫细胞出现缺失。同样的，足细胞在snRNA-seq中只占0.7%，而在scRNA-seq中占3.28%，snRNA-seq中更丰富的细胞类型包括亨利氏套细胞和系膜细胞（图6A）。scRNA-seq中唯一被恢复的细胞类型是巨噬细胞，而在scRNA-seq文库中，还检测到了T细胞(平均1.38%)、B细胞(0.77%)和NK细胞。

通过分析肾脏上皮细胞类型，某些类型的细胞，如足细胞在scRNA-seq中比例与肾脏解剖估计结果最相似，而对于其他类型的细胞，如亨利氏套细胞，snRNA-seq能更好的捕获（图6B）。另外发现基于完整肾脏的Bulk RNA评估出的细胞构成比例很大程度上与解剖评估结果相矛盾，这可能反映了样本不准确的反褶积结果。最后，比较完整肾脏Bulk RNA和雌性Balb/c小鼠冷解离细胞悬液的Bulk RNA，提示细胞类型在完整肾脏和解离后肾脏中可能存在不均等。

图6

4参考文献：

Elena et al., (2020) Systematic Assessment of Tissue Dissociation and Storage Biases in Single-Cell and Single-Nucleus RNA-seq Workflows, Genome Biol, DOI: 10.1186/s13059-020-02048-6.

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