长期使用污泥污水对农田微生物的影响 | 微生物专题
编者说
对土壤中抗性基因以及群落多样性的研究离不开宏基因组测序分析，同时作者采用的跨时间梯度的耐药性以及生物报告研究也是非常值得学习的。本文除了采用非常丰富的实验方法，同时借用了高通量测序的技术手段，不同维度地来确认污泥污水对农田微生物结构以及抗性基因的影响，最终得到的结论充分，对环境治理以及农作物生产有深刻的指导意义。
摘要
在耕地上施用污泥是目前针对土壤改良以及作物种植的普遍做法，该方法利用了污泥中作物必需的养分，减少了对无机肥料的需求，但这种应用也增加了由污泥中的化学污染物和微生物病原体产生的风险，这种做法可能会促进抗药性细菌或抗药性基因的环境选择和传播。了解污泥改良剂与抗生素耐药性发展相关的风险，对于可持续农业、废物处理和传染病管理非常重要。本文通过对试验地不同时期微生物抗生素抗性及抗性基因富集的情况进行研究最终发现，污泥长期施用前后土壤中没有抗药性细菌或抗性基因富集的迹象，同时微生物群落构成也只有很少的差异。
发表期刊：Environment International
发表时间：2020
影响因子：7.943
研究内容：宏基因测序与代谢组技术研究污泥长期施用对微生物群落组成及抗药性的影响
对象与方法
土壤样本来自一项农业田间试验，该试验旨在调查施用污水污泥对土壤质量和作物产量的长期影响。土壤为砂壤土，为该地区的典型土壤，有机质含量约为2%，粘土含量约为14%。这块地被分成36个地块(每个6×20m2)，每四年每公顷施用0、4或12吨(干重)的污泥。
自1981年实验开始以来，种植的作物，冬小麦，甜菜，春大麦和油菜，每四年轮换一次。在过去的四年周期中，每年向土壤地块提供每种作物所需氮肥的0、50或100%，相当于小麦140公斤/公顷、甜菜和大麦120公斤/公顷和油菜170公斤/公顷。土壤样地样本矩阵总共包含9种不同的污泥改良剂和氮肥组合，每种组合有4个重复。最终排除给予1/2正常氮量的地块，对剩余24块地分别于2013年与2017年进行2轮采样（表1）。同时采样一次消化、贮藏污泥；在两次情况下，还从未消化的污泥(称为生污泥)和消化过程中直接从密闭室中的污泥(称为半消化污泥)中采集抓取样本。总共获得24+24个土壤样本和1+2+2个污泥样本(n=53)，用于后续化学分析、DNA提取和测序。采用液相色谱-串联质谱法测定了土壤和污泥中15种抗生素和一种抗菌剂（CTAC）的浓度。利用Bioreporter分析（类似于生物传感器，在细菌中加入一些诸如生物发光基因启动子，然后引导出相应蛋白或因子表达）测定铜和锌的生物利用性（表2），在Cu、Zn可利用性物种中诱导金属调控的LuxAB基因表达。通过宏基因组测序鉴定ARGs（抗生素抗性基因）、MRGs（金属抗性基因）、BRGs（杀菌剂抗性基因）和MGEs（可移动遗传因子）以及crAssphage（噬菌体）。16S rRNA基因测序进行进行物种鉴定和分类。通过菌落培养计数在不添加抗生素的相应琼脂平板上用样品特异性归一化方法测定氨苄西林、四环素和环丙沙星的相对耐药水平（图2）。
表 1样本组成
表 2 Cu的生物可利用性测定
图1不同抗生素相对耐药水平
结果展示
污泥和土壤中的抗菌剂浓度
在原始和半消化的污泥抓取样本中，4个样本中只有一个样本未检测到四环素，其余均在可定量的水平上含有8种抗生素类化合物。除强力霉素和四环素在半消化污泥中的含量在两个时间点均高于未消化污泥外，大部分化合物在部分消化后仍处于较低的浓度水平。在污泥施用前采集的土壤样本中，没有一种被分析的化合物被检测到。污泥改良两周后，环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和四环素在至少一个土壤样本中可以定量，但没有一个样本含有超过两个被检测到的化合物。除CTAC外，未加污泥改良剂的样品中均未检出抗生素。
土壤中铜、锌的生物可利用性
在最近一次污泥施用近四年后，从第一轮采样开始，污泥修正的地块中的生物有效铜([Cu]bio)略高于对照土壤中的生物有效铜([Cu]bio)。相对生物利用度(即。[Cu]BiO/[Cu]总量)为0.03-0.04%，与田间处理无关(表2)。生物报告数据表明，所有处理中生物有效铜和锌的水平都很低，只有污泥施用量对生物有效铜[Cu]bio的影响很小。
宏基因组测序
每个样本测序数据量在4.8到11G之间。通过对达到饱和和丰度阈值ARGs的累积分析排除了4个高丰度reads的基因(qxB、aadA2和ant(3’’)-Ia的ARGs和MGE整合子整合酶intI6)，以避免由于这些基因掩盖丰度变化。只比较第二轮采样中接受0吨/hm2或12吨/hm2污泥，不加氮肥的样地，在ARGs、MRGs、BRGs、MGEs或细菌群落组成方面没有显著差异。因此，下面报告的只是包括所有土壤样本和三个自变量(污泥施用量、采样时间点和氮肥)的分析结果。
不同土壤处理间的累积ARGs差异不显著，总共在土壤和污泥样本中检测到335种不同的ARG。然而，这些基因中的大多数只有很少的read丰度支持，只有6个基因oqxB、OtrA、ETV、aadA2、ant3’’-Ia和另一个OtrA变异体（tet）超过了阈值用于单个ARG分析。唯一具有显著差异的ARG是oqxB，它在施氮肥的土壤中有所增加(FC=1.15,FDR=0.008)，在第二轮采样中比第一轮(FC=0.91FDR=0.004)有所下降。在评估污泥应用效果时，没有观察到ARG水平的显著变化。在单株MRG研究中，氮肥增加了CTPC(FC=4.25,FDR=0.013)和nikR(FC=2.00,FDR=0.022)的丰度，而降低了ziaA的水平(FC=0.40,FDR=0.013)。污泥改良剂和采样时间点均不影响单个MRG的水平。不同处理间的BRG总数没有显著差异。然而，在个体基因水平上，第二轮采样的样地显示ActA的丰度降低(FC=0.65，FDR=0.040)，而表3根据过度分散的三个自变量(污泥施用量、采样时间点和施氮量)的广义线性模型，总结了土壤样品中5个分类级别的统计显著性差异(FDR<0.040)。正号和负号分别表示施用污泥、第二轮采样和添加氮肥时特定分类群读数的增加或减少。从第二轮采样开始，土壤中总的镁锗丰度显著增加(FC=1.26，p=0.030)。污泥施用和氮肥施用对总MGE丰度都没有显著影响，但当对单个基因进行分析时，Iscr2在污泥改良的土壤中明显更丰富。
在污泥处理过程中，ARGs和crAssphage的相对丰度都有所下降，并呈正相关(图2A)。然而，如果只包括土壤样本，则无法发现这两者之间的相关性（图2B）。
表 3三个自变量(污泥施用量、采样时间点和施氮量)的过度分散广义线性模型结果
图 2 土壤和污泥样品中ARG和CrAssphage丰度的相关性
长期施用污泥对土壤细菌群落组成的影响很小。只有一个迷踪菌门Elusimmicrobia和一个纲(来自Chloroflei门的TK10纲)的序列在污泥改良的土壤中显著富集。但包括在分析中的47个土壤样本中，有31个样本没有序列被映射到Elusimmicrobia门，因此无法计算该门在不同条件下的差异。这项研究中使用的系统发育分析的分辨率一般不能确定具体的物种，因此选择了11个属，包括在原始污泥中发现的革兰氏阴性病原体(严格的或条件性的)，并将它们的丰度在样本之间进行了比较。消化效果明显，在半消化污泥中检测不到7个属的read。与原始污泥相比，其余属的总相对read数平均低7倍。所有样本中都发现了与假单胞菌匹配的序列。土壤样品中这11个属的总相对read数比施用污泥低一个数量级，不受污泥改良剂、采样时间点或施氮量的影响。
培养数据
在用于培养分析的所有类型的平板上，半消化污泥的CFU/g(干重)都低于生污泥。大肠杆菌(图1A)下降了10至250倍，其他大肠菌群(图1B)下降了100至1,500倍，异养菌(图1C)下降了2至200倍。此外，消化和储存污泥中的大肠杆菌数量也有所减少。对于大肠菌群，在消化和储存的污泥中没有检测到对环丙沙星有抗药性的菌落，但对于其他抗生素，大肠杆菌没有观察到明显的减少，而且四环素抗药性大肠菌群在完全处理的污泥中甚至比在半消化的污泥中更丰富。在R2A平板上也看到了类似的模式，在露天储存11个月的消化污泥的菌落计数比半消化污泥高3到19倍(图1C)。在未添加补充剂的平板上菌落计数归一化后，所调查的三种抗生素在消化和储存的污泥中的相对抗性水平低于R2A平板上未经消化和半消化的污泥抓取样品的平均水平。
使用采样前两周不接受氮肥和0吨/hm2或12吨/hm2污泥的地块的数据，在假定的大肠杆菌、其他大肠菌群或异养菌丰度方面，各处理组之间没有统计上的显著差异。土壤中假定的大肠杆菌和其他大肠菌群的计数。根据颜色，ECC平板上计数出两种类型的菌落，大肠杆菌(蓝色)和其他大肠菌群(红色)。在第一轮抽样中，在24个土壤样本中的3个没有使用抗生素的ECC平板上发现了假定的大肠杆菌。在第二轮采样中，在最近一次施用污泥15天后，23个土壤样本中有11个可以检测到大肠杆菌，但重要的是，这次在ECC板上的稀释土壤样本减少了10倍，因此检测下限降低了一个数量级(图3)。三个变量(污泥FDR=0.21，采样时间点FDR=0.63，氮肥FDR=0.63)在未添加ECC平板上的假定大肠杆菌丰度均无显著变化(污泥FDR=0.21，采样时间点FDR=0.63，氮肥FDR=0.63)。所有泥土样本均没有发现对氨苄青霉素、四环素或环丙沙星有抗药性的大肠杆菌。归一化后，耐四环素大肠菌群的相对丰度仅在采样时间点显著增加(FC=5.16，FDR=0.016)(图4A)。氨苄青霉素抗性大肠菌群的相对丰度在不同处理之间没有显著差异(图4b)，在两个采样时间点的土壤样本中都没有发现抗环丙沙星大肠菌群。
图 3不同时期假定大肠杆菌与其他大肠菌菌落计数
图 4添加8µg/ml四环素的ECC平板上大肠菌群的相对抗性水平
总结
通过最近一次污泥施用之前的土壤样品中没有检测到所调查的抗生素，这表明36年的污泥改良并没有导致这些抗生素在土壤中的积累。在污泥施用15d后进行的土壤采样中，所有检测到抗生素的样品都来自改良区，但在污泥处理的土壤中没有发现一致的化合物，检测到的浓度与污泥施用量没有明显的相关性。通过对耐药细菌和耐药基因本身的研究更好地评估抗药性选择的风险，没有发现污泥改良剂对ARGs有任何明显的影响，与改良剂土壤中抗生素残留物没有选择性作用是一致的。无论是短期还是长期，都找不到证据表明抗生素在土壤中积累，或者ARGs或ARBs在土壤中富集，表明污泥施用前后没有抗药性细菌或抗性基因富集的迹象。同时对微生物群落测定也发现只有很少的差异。
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