每个宿主体内都有独特的肠道微生物结构，且随着时间推移而逐渐稳定，说明宿主能够选择性的塑造肠道菌群。宿主究竟如何选择性地塑造肠道菌群，一直以来没有得到很好的解释。Roopali Gandhi等2016年在Cell Host & Microbe上发文“The Host Shapes the Gut Microbiota via Fecal MicroRNA”，该研究发现宿主可以通过粪便miRNA介导的物种间基因调控塑造体内的微生物群。
文献题目：The Host Shapes the Gut Microbiota via Fecal MicroRNA
发表杂志：Cell Host & Microbe
影响因子：15.923
发表日期：2016年1月
研究概述
作者发现宿主肠道上皮细胞（IEC）和Hopx+细胞是粪便miRNA的主要来源。并证实miRNAs能进入细菌内并调节细菌的基因表达,影响细菌的生长。IEC-miRNA缺陷型(Dicer1ΔIEC)小鼠表现出肠道菌群失调且结肠炎病情加重，而移植野生型小鼠的粪便miRNA可恢复缺陷型小鼠的肠道菌群,并改善结肠炎。这些发现既确定了粪便miRNA能够塑造肠道微生物群结构，也明确了宿主操纵肠道微生物的潜在策略。
研究背景
人体肠道内有一个复杂的微生物群，最初由来自母亲的微生物组成，并通过母乳喂养和其它环境接触持续发展，随着时间的推移逐渐稳定，在幼儿3岁时肠道微生物群结构接近于成人。促进哺乳动物体内微生物群形成的因素很多，包括宿主遗传、饮食和疾病状态。相同物种的体内微生物结构有一定相似性，但不同物种间的体内微生物结构往往有很大不同。有报道称，将斑马鱼和小鼠肠道的道微生物群落交换移植到无菌受体中，受体的微生物结构更类似于自身所属的物种而不是供体，说明宿主体内具有维持自身体内微生物结构的机制。microRNAs(miRNAs)是一种非编码小RNA，长度为18-23个核苷酸， 通常是由较大的的茎环结构前体经 Dicer 酶切割而成。miRNAs在细胞核中合成，在细胞质中加工并发挥作用。然而，越来越多的证据表明miRNAs可以存在于细胞外，并在体液中循环。有报道称人类粪便中也存在miRNA,可作为作为肠道恶性肿瘤的潜在标记物。但正常肠道中是否存在功能性粪便miRNA尚不清楚。而此项研究表明，miRNA是人类粪便中的普遍成分，且在调节肠道微生物结构中发挥作用。
研究结果
1.小鼠和人粪便中miRNA的鉴定作者对人和小鼠粪便样本中分离出的RNA进行分析鉴定，发现了三个主要的小RNA峰：~ 20nt，~65nt和~100nt，类似大小的小RNA大多为miRNA。而后，作者使用NanoString nCounter技术分析了人和小鼠粪便miRNA。在小鼠粪便样本中共检测了566个miRNAs，检测到的有283个，其中miR-1224、miR-2146、miR-2134、miR483、miR-710、miR-2141、miR-720、miR-155和miR-34c丰度最高。在人类粪便样本中，共检测了800个miRNAs，有181个被检测到，其中miR-1246、miR-601、miR-630、miR-2116-5p、miR-320E、miR-1224-5p、miR-155-5p和miR-194-5p丰度最高。比较小鼠和人类粪便中含量最丰富的50个miRNAs，有17个相同(图1C)。肠腔的不同部位的miRNA表达量分析显示：肠道不同区域的miRNAs有显著差异，回肠腔中的miRNAs比结肠腔更为丰富(图1D)。作者比较了无菌(GF)小鼠和无特定病原（SPF）小鼠的粪便miRNA表达水平。发现GF小鼠的粪便miRNA丰度高于SPF小鼠 (图1E)。同时，用抗生素清除小鼠肠道中的微生物会导致小鼠肠腔内miRNA丰度升高(图1F)，证实肠道微生物环境对粪便miRNA有一定的影响。图1.粪便中miRNA和肠腔内容物的鉴定(A)小鼠粪便中含量最高的50个miRNA。(B)人类粪便中含量最高的50个miRNA。(C) 图(A)和(B)中人类和小鼠粪便中含量最高的50个miRNA有17个重合。(D-F)基于NanoString检测的miRNA表达水平差异，上图：火山图，下图:PCA分析。（D）结肠腔与回肠腔。(E)无菌(GF)小鼠粪便与SPF小鼠粪便。(E)抗生素处理(ABX)小鼠肠腔与SPF小鼠肠腔。2.肠上皮细胞和Hopx＋细胞是粪便miRNA的两个主要来源通过Cre-floxp系统特异性敲除小鼠IECs细胞、Hopx+细胞和淋巴细胞中的dicer,构建上述细胞中miRNAs特异性缺失的小鼠。发现Dicer1ΔIEC和Dicer1ΔHopx小鼠的粪便miRNA丰度降低，图谱也发生了变化，说明肠上皮细胞和Hopx+细胞是粪便miRNA的主要来源。同时，被DSS处理破坏肠道上皮细胞的小鼠的粪便miRNAs显著减少(图2C)。也证实肠道上皮细胞在粪便miRNAs的产生中起到关键作用。图2.基因NanoString检测的粪便miRNA表达水平火山图：(A)Dicer1ΔIEC与Dicer1fl/fl小鼠 (B)Dicer1ΔHopx与Dicer1fl/fl小鼠 (C)DSS处理与naïve（对照组）小鼠；(D)：Rag1-/-与B6（野生型）组。3．IEC miRNA缺陷型小鼠肠道微生物群落差异性增加作者使用Illumina MiSeq平台对Dicer1ΔIEC小鼠和作为对照的Dicer1fl/fl小鼠粪便细菌的16SrRNA基因高变区V4进行测序，并用QIIME软件进行分析，将测得的序列分类到1895个可操作的分类单元（OTU）中。结果显示Dicer1ΔIEC小鼠粪便的微生物结构与对照小鼠有明显差别(图3A)。UniFrac是从进化的角度比较两个不同微生物群落的差异的方法，可用于β多样性的评估分析，即对样品两两之间进行比较分析，得到样品间的UniFrac距离矩阵。加权UniFrac分析就是在UniFrac的基础上,将序列的丰度纳入考虑,它能够区分物种丰度的差别。基于UniFrac的PCoA分析显示，与Dicer1ΔIEC小鼠相比，Dicer1ΔIEC小鼠中微生物群的系统发育多样性更加丰富，非加权UniFrac分析(图3C)和加权UniFrac分析(图3D)都证实了这一点。针对WT小鼠中检测到的三个最主要的细菌家族：普雷沃泰尔科、卟啉单胞菌科和乳螺科(图3A)进行分析。结果显示，上述细菌家族在Dicer1ΔIEC小鼠体内的β多样性指数显著高于WT小鼠 (图3E-3G)。此外，基于Bray-Curtis 的β多样性分析证实了Dicer1ΔIEC小鼠体内的微生物多样性在属水平上也显著高于野生型。图3.基于16SrRNA序列的微生物多样性分析。(A)细菌的在科水平上的相对丰度 (B)基于加权UniFrac PCoA分析。(C-H) Dicer1fl/fl小鼠和Dicer1ΔIEC小鼠微生物群落β多样性评估分析箱线图。(C-G)科水平上的β多样性评估，(C)未加权UniFrac分析，(D)加权UniFrac分析，(E) 科普氏菌科，(F)卟啉单胞菌科，(G) 毛螺菌科。(H)属水平上的β多样性评估。4.宿主miRNA在体外影响肠道细菌的生长作者验证了两种肠道细菌：厌氧细菌核梭杆菌(Fn)和兼性厌氧细菌大肠杆菌(E.coli)在添加miRNA的培养基中的生长情况。首先通过miRBase数据库确认细菌（7种）核酸序列中是否有miRNAs的靶点。预测结果显示，Fn、E.coli和节段性丝状细菌(SFB)的核酸序列含有miRNAs的靶点，miR101、hsa-miR-515-5p、miR-876-5p、hsa-miR-325和hsamiR-1253可能靶向Fn核酸序列；hsa-miR-4747-3p、hsa-miR-1224-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-623可能靶向E.coli核酸序列，作者用这些miRNAs的模拟物体外培养Fn和E.coli，发现hsa-miR-515-5p促进了厌氧细菌核梭杆菌Fn的生长(图4A)，而hsa-miR-1226-5p促进了大肠杆菌的生长(图4B)。对照miRNAs对目标细菌没有生长促进作用(图4A-4B)，表明这种影响是序列特异性的。图4. 宿主miRNA直接影响肠道细菌的生长 (A、B)细菌体外培养实验 (A)Fn在添加hsa-miR-515-5p miRNA模拟物、hsa-miR-515-5p突变体miRNA模拟物、hsa-miR-1226-5p加扰对照的培养基中的生长曲线。(B)大肠杆菌在含有hsa-miR-1226-5p miRNA模拟物、hsamiR-1226-5p突变体miRNA模拟物、hsamiR-1226-5p加扰对照和hsa-miR515-5p miRNA模拟物的培养基中的生长曲线。5.宿主miRNA可以进入细菌内并调其基因转录研究者用添加了Cy3荧光标记的miRNAs模拟物的培养基，培养能够表达GFP的大肠杆菌(E.coli-GFP)。在激光共聚焦显微镜下观察到miRNAs可以进入细菌并与细菌核酸共定位(图5A-5D)。此外，作者通过流式细胞仪观察到培养过程中miRNA在细菌中的动态积累(图5E和5F)，为miRNA与细菌核酸的相互作用提供了时空基础。作者发现，培养基中添加miR-515-5P miRNA模拟物促进Fn 16S rRNA/23S rRNA转录本的比例升高(图5G)。同样，培养基中添加miR-1226-5p miRNA模拟物能使大肠杆菌yegH mRNA表达量升高(图5H)，证实miRNA能够特异性的调控细菌内的基因表达。作者对miR-515-5P和miR-1226-5P的预测配对位点进行了突变(图4)。发现突变后的miRNAs对细菌内基因表达的调控作用和促生长作用都有所减弱(图4)。图5.宿主miRNA能够进入细菌内并特异性调控细菌基因表达
(A-D)GFP标记的大肠杆菌在添加了带有Cy3荧光标记的hsa-miR-1226-5p miRNA模拟物的培养基中培养，加扰hsa-miR-1226-5p和hsa-miR515-5p miRNA模拟物做为对照 (E)Fn在添加了Cy3荧光标记的hsa-miR-515-5p miRNA模拟物的培养基中培养，加扰hsa-miR515-5p和hsa-miR-1226-5p作为对照， 培养0,5min,6 h，12 h后用流式细胞仪检测带有有Cy3荧光标记的细胞比例。(F) GFP标记的大肠杆菌在添加了Cy3标记的hsa-miR-1226-5p miRNA模拟物的培养基中培养，培养0,5min,6h，12后用流式细胞仪检测带有Cy3荧光标记的细胞比例。(G)Fn在分别添加空载体、hsa-miR-515-5p加扰对照、hsamiR-515-5p miRNA模拟物、hsa-miR-515-5p突变体miRNA模拟物和hsa-miR1226-5p miRNA模拟物的培养基中培养16h。提取RNA，qPCR检测并计算Fn 16S rRNA和23S rRNA转录水平的比值。(H)大肠杆菌在分别添加空载体、hsa-miR-1226-5p加扰对照、hsamiR-1226-5p miRNA模拟物、hsa-miR-1226-5p突变体和hsamiR-515-5p miRNA模拟物的培养基中培养4h。提取RNA，qPCR检测大肠杆菌yegH mRNA表达水平。6. 移植WT小鼠粪便miRNA可恢复IEC miRNA缺陷小鼠的粪便微生物群作者用通常不存在于小鼠粪便中的Fn给Dicer1ΔIEC小鼠及WT小鼠灌胃，结果显示，与Dicer1ΔIEC小鼠相比，WT小鼠粪便中的Fn丰度明显更高(图6A)。作者从WT和Dicer1ΔIEC小鼠的粪便中提取RNA，通过灌胃的方式移植给Dicer1ΔIEC受体小鼠 (图6B)。7日后，通过 16SrRNA测序检测受体小鼠体内的微生物结构。结果显示，与供体为Dicer1ΔIEC缺陷型的小鼠相比，供体为WT小鼠的Dicer1ΔIEC受体小鼠肠道菌群的β多样性更低，更接近WT小鼠。同时，通过qPCR检测三种细菌SFB、大肠杆菌和脆弱芽孢杆菌，以及7种丰度较高的OUT在受体小鼠体内的丰度，在检测的10个菌种/OUT中，有7个在移植WT小鼠粪便RNA后得到了恢复。证实了粪便miRNA移植对小鼠的肠道菌群有一定的修复效果(图6G-6P)。在WT小鼠的饮用水添加miR-4747-3p和miR1226-5p，48小时后检测发现饮用水中含有miR-1226-5P的小鼠粪便中大肠杆菌的丰度有增加(图6Q)。图6. 移植粪便RNA使IEC miRNA缺陷型小鼠的粪便微生物群得到恢复(A)Fn灌胃Dicer1fl/fl和Dicer1ΔIEC小鼠，qPCR检测小鼠在灌胃后6天粪便中Fn的相对丰度 (B)(C)-(P)的粪便RNA移植示意图：供体粪便RNA(feRNA)从Dicer1fl/fl 和Dicer1ΔIEC小鼠中分离出来，通过灌胃移植给Dicer1ΔIEC受体小鼠（每天1次，连续7天)。(C和E)基于加权UniFrac的PCoA分析，(C)所有细菌，(E)卟啉单胞菌科。(D和F)β多样性评估箱线图，(D)所有细菌，(F)卟啉单胞菌科。(G-P) qPCR测定受体小鼠体内菌群的恢复情况， (G) SFB、 (H)大肠杆菌、(I)脆弱芽孢杆菌、(J) OTU00015、(K) OTU00025、(L) OTU00045、(M) OTU00145、(Q)给C57BL/6J小鼠饮用含有miRNA模拟物的饮用水后，用qPCR法测定粪便中大肠杆菌的相对丰度。7.WT粪便miRNA移植改善Dicer1ΔIEC小鼠的DSS诱导性结肠炎症状作者使用DSS诱导小鼠结肠炎。发现与WT小鼠相比，Dicer1ΔIEC小鼠病症更严重(图7A-7C)，将WT和Dicer1ΔIEC小鼠的粪便RNA通过灌胃的方式移植给Dicer1ΔIEC受体小鼠(图7D)。7日后，供体为WT小鼠的受体小鼠病症减轻(图7G)。证实肠腔miRNAs对于保护肠道上皮屏障完整非常重要。图7.IEC miRNA缺失与DSS诱导型结肠炎症状加重有关，并在移植 WT小鼠粪便RNA后有所改善。在6周龄Dicer1fl/f1和Dicer1ΔIEC小鼠的饮用水中添加3%的DSS,7日后测定各项指标。(A)体重百分位数变化，(B)结肠长度。(C)DSS给药后第9天进行组织学分析。(D)粪便RNA转移和结肠炎诱导示意图：供体粪便RNA从Dicer1fl/fl和Dicer1ΔIEC小鼠粪便中分离出来，给Dicer1DIEC受体小鼠灌胃，每日1次。7日后，再用3%DSS饮水诱导小鼠结肠炎。(E-G)受体在给药后第9天检测体重变化、结肠长度以及组织学分析。
讨论
此项研究确认了粪便miRNA是哺乳动物肠腔内的普遍成分。并进一步证明，粪便miRNA能够特异性地调控细菌基因表达，从而调节肠道菌群，是宿主的一种防御机制，在宿主生理和病理中起到重要作用。2020年8月17日，南京大学张辰宇教授团队在 Cell Research 杂志发表最新研究成果：SIDT1-dependent absorption in the stomach mediates host uptake of dietary and orally administered microRNAs。证实哺乳动物能够吸收胃中的食物miRNA，并使其在动物体内发挥生物学功能，这一结果再一次有力的证实了miRNA具有跨物种调控的能力。在此基础上，进一步研究宿主通过miRNA与体内微生物之间相互作用，维持体内微生物环境平衡进而保护宿主身体健康的详细机制，变得十分有意义。相关阅读
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