Environmental Microbiology/ Venn图：寻找核心微生物组 | 微生物专题
The following article is from 植物与根际微生物生态 Author 一起学根际微生态
题目：Beyond the Venn diagram: the hunt for a core microbiome
Venn图：寻找核心微生物组
期刊：Environmental Microbiology（2012）
三年均IF：5.12
作者：Ashley Shade(点击看文章） & Jo Handelsman
发现核心微生物组对理解复杂群落中稳定一致的组分十分重要，核心通常被定义为来自相似生境的微生物群落之间共享的一组成员，并由维恩图中圆圈的重叠区域表示，其中每个圆圈包含被比较的样品或生境的成员。评估基因表达的组学方法可以丰富对核心微生物群的生态学见解，从而将核心的概念从分类学定义的成员扩展到群落功能和行为。由传统生态学理论定义的参数，如组成、系统发育、持久性和连通性，也将对核心微生物群进行更复杂的描述，并促进对关键微生物的作用以及生态系统内和生态系统间功能的理解。
核心微生物群由两个或两个以上与一个栖息地相关的微生物群落共有的成员组成，识别核心物种(可操作分类单位，OTUs)对于揭示微生物群落的生态学是至关重要的，因为已经有人提出，出现在与特定生境相关的所有群落中的这些常见生物可能对该类型群落的功能至关重要。因此，确定核心是定义“健康”群落和预测群落对干扰的反应的第一步。了解什么是核心成员将指导操控群落以实现预期的结果。这些见解将有助于解决这十年来微生物生态学的两大挑战:预测全球变化对生物地球化学循环的影响，以及管理人类微生物群以增进人类健康。
确定人类微生物群是否有核心是美国国立卫生研究院人类微生物群项目的目标。因此，许多研究旨在发现和比较与健康和疾病状态下的哺乳动物宿主相关的核心。这些关于核心的研究与主要类群同样引起人们极大的热情。核心的概念不限于与宿主相关的微生物群。环境微生物学家长期以来一直就自由生活的微生物群落提出类似的问题。短语“核心微生物群”可用于描述土壤、湖泊或废水处理系统中共享的成员。人类微生物项目重燃了经典问题的流行:这些核心微生物对群落有哪些作用？
2009年，Hamady 与Knight提出了关于人类个体核心性质的观点:核心可能是实质性的(其中大部分微生物类群是共享的)；最小的、不存在的或梯度的(例如，沿着某种饮食或其他环境连续体)。他们还认为，一些核心只在宿主的亚种群中共享，而不是宿主物种的所有个体。这些深思熟虑和及时的想法为探索大型微生物组数据集提供了一个起点。尽管对核心的关注有所增加，但核心的构成仍然难以捉摸。一种典型的方法是基于存在/不存在数据集，研究从相似栖息地跨地点发现的物种数量。结果在维恩图的视觉上，圆圈代表不同的微生物群，它们的重叠区域代表核心。虽然维恩图是一个合理的初步探索，但它的概念基础忽略了生态特征，而生态特征可能暗示了一种更微妙的理解，即成员存在与他们在一种生态系统功能相关。
在这里，我们提出了一个识别核心微生物群的概念框架。从代表成员维恩图开始，通过结合组成、系统发育、持久性和连接性，增加了复杂性的层次。目标是考虑核心微生物生态的各个方面，并从传统生态学中引入一个概念框架。最后，这些例子提供了讨论和未来研究。
核心通用定义导致数据集呈现为OTU表。OTU表有一行中的每个OTU(“物种”或感兴趣的单位)和群落观察(例如采样单位)。表格中充满了关于OTU事件的数字信息。OTU表不必局限于基于16S序列的宏基因组数据；它可以包括来自各种组学方法的数据，例如蛋白质或代谢物的丰度、与芯片上核酸探针的杂交强度或功能基因簇的存在/缺失。我们用微生物群来描述与栖息地相关的微生物群落，无论是活跃的还是不活跃的。栖息地是决定特定环境区域或地点的生物生态位空间的非生物组成部分。一个典型的观察是来自一个地方的一个时间点的一组微生物相关数据(例如，16S，转录组，宏基因组)，但是相关的核心微生物群比较通常是在相似的栖息地进行的。微生物群落是微生物组的相互作用子集，是生态系统的活跃部分，包括生境中非生物和生物成分的相互作用动态。
成员:共享存在
图A：基于共享成员的核心。输入OTU表是存在/不存在，共享存在的出现在感兴趣的群落中进行计数。
成员分析考虑了存在于两个或多个微生物群中的共享分类群(或基因)。这是基于存在/不存在数据集，其中共享的otu被计数(图1A)。维恩图的视觉显示了重叠的数量，但是对于多于四个类别组的表示无效。Sørenson指数说明了每组中共享的和唯一的otu的数量，也描述了基于成员的核心微生物群。
在与人类相关的联合体中已经观察到成员核心，但是具有可变性。在肠道中，个体之间通常有少量的共有系统发育型，表明成员核心最小。相反，三个个体的口腔微生物群落系统型有很大的重叠。在阴道和肠道微生物群中发现了“clusters”和“enterotype”核心，而不是在个体间观察到的成员核心，这支持了Hamady 与Knight亚种群假说。一项对瘦双胞胎和肥胖双胞胎核心基因的宏基因组研究显示，假设对肠道适应生活方式(如碳水化合物代谢)重要的基因高度重叠。这些共享基因被描述为“核心”功能，而那些不共享的基因是“可变的”，用于识别与肥胖唯一相关的途径。值得注意的是，测序深度可以改变对核心系统型或基因比例的解释，正如前人所表明的，3个测序深度揭示了比1个覆盖范围大25%的核心。总之，这些研究和其他研究表明，基于成员的核心依赖于环境、测序工作和宿主群体。
组成:优势、稀有和中间类群
图B:基于共享组成的核心。在本例中，只有共享且比例相似的OTU才计入核心。
维恩图分析忽略了组成，这解释了每个OTU的相对丰度，探索微生物群落的多变量分析(多维标度或基于距离的分析)更加重视更丰富的otu，导致由最丰富的otu驱动的模式。相比之下，维恩分析对所有观察到的OTU进行同等加权，无论它们在群落中的代表性如何。
解释组成可以提供关于核心微生物群的关键生态信息(图1B)。核心分析可限于特定丰度范围内的OTU子集；这就排除了在群落中有着完全不同代表性的otu。在数量上占优势的生物推动了群落水平的分析，但是通过移除占优势的成员来突出稀有成员的贡献可能是有益的。例如，在对淡水细菌的分析中，根据16S RNAgene转录的水平评估，稀有OTUs的成员与普通OTUs相比具有不成比例的生理活性。值得注意的是，“普通”otu，即那些既不占优势也不稀有且始终处于中间的otu，经常被忽视。然而，这些生物可能共同作为支撑骨干，与一致的生态系统功能相关。成分核心的识别为理解占主导地位的、稀有的和常见的otu的独特贡献提供了基础。
为了在核心分析中考虑组成，可以为每个微生物组创建秩丰度曲线(物种丰度分布)。可以进行有根据的“cut-offs”来分离最丰富和最不丰富的otu。传统生态学文献建议，最丰富的10%应该被认为是占优势的，最不丰富的65%应该被认为是稀有的。然而，微生物秩丰度曲线通常包括非常少的优势成员和许多稀有成员的长尾。这导致了一个高度“倾斜”的等级丰度分布，可能需要对优势、常见和罕见的otu进行不同的定义。物种多度分布的理论和应用在经典生态学文献中被积极讨论，这可以为优势和稀有的概念提供信息，并为微生物生态学中的定义提供指导。
系统发育和功能冗余
图C：包含系统发育信息的核心。相关的OTUs作为一个单元被计算到核心，就像谱系ii中的OTUs 1和2一样。系统发育水平可以上调或下调。
描述组成和功能的关系是微生物生态学的一个中心挑战。功能和组成在某些系统中是联系在一起的，但在另一些系统中却不是。此外，一些功能仅限于某些分类群(如硫酸盐还原)，但其他功能在不同的群体中广泛存在(如光合作用)。微生物组可能包含系统发育和功能冗余。当来自同一谱系的多个OTU存在于一个微生物组中时，发生系统发育冗余，而当多个OTU在一个微生物组中执行相同的作用(例如固氮)时，发生功能冗余。谱系内部和之间的关系可以通过从组学数据集构建系统发生树来假设。当来自同一谱系的OTU也具有相似的功能时，系统发育和功能冗余可能重叠。然而，每种类型的问题都与计算多样性的建议相似:在核心的定义中，冗余的otu是否应该与唯一的otu同等计数(图1C)。
冗余对于定义和解释核心很重要。例如，干扰生态学假设一个强健的群落包含多个扮演相似角色的物种(如“保险假说”)。如果这个原则适用于微生物群落，多余的成员可以缓冲干扰反应。例如，如果不是所有功能冗余的成员都对抗生素敏感，那么在应用抗生素后，冗余可以使群落功能恢复。
许多组学研究提供了OTUs的分类，并且经常可以被分析以识别微生物组中的系统发育信号。第一步是确定数据集是否包含指示环境过滤的系统发育信号。环境过滤是一种化学或物理约束，它将群落成员限制在那些能够很好地适应环境条件的生物体中。极端环境过滤的例子有热液喷口附近的高压、某些昆虫内脏中的高酸碱度或温泉中的高温。由系统发育信号指示的环境过滤表明系统发育和功能冗余的同时发生，这反过来可以揭示驱动跨生境微生物群落结构的环境条件，从而阐明组成和结构可能的跨系统预测因子。
系统发育信号可以通过系统发育物种变异性或系统发育物种均匀性的分析来识别。这些检验中的一个关键假设是，密切相关的物种对环境因素的反应相似。如果一个微生物群由比预期更紧密相关的分类群组成，表明存在环境过滤，如在水生、土壤和沉积物生态系统中所研究证明的。
微生物组的更多信息将为功能冗余的假说提供基础。在缺乏关于分类群功能作用的足够信息的情况下，系统发育信号可以预测OTUs的功能作用以及核心微生物组是否包含冗余。
持久性:微生物群动态
图D：核心微生物群，包括在一系列中持续存在的OTUs。在一个群落中持续观察到的otu被视为核心。(此处显示为每个群落A和B的连续时间点1、2和3)。
微生物群在时间和空间上是动态的。时间和空间采样将识别在微生物组中持续检测到或持续存在的OTUs(图1D)。短暂的OTU可能是一个方法上的错误，也可能是非本地的“游客”物种。淡水系统的研究表明，单个OTU动态不一定反映整个微生物群的动态，由相似响应模式组装的OTUs揭示了对环境变化的不同响应的复杂性。对于与宿主相关的微生物群落，时间核心可以被定义为那些存在于宿主不同发育阶段的生物，这必然与时间有关，但给研究者和微生物带来了其他实验和生物学挑战。因此，解释持久性的变化可能有助于理解核心。
得到观察结果后，核心的定义可能会被限制为在所有观察结果中检测到的持久OTU，或者出现模式的子集。例如，最近一项揭示核心肠道微生物群的Meta分析包括在四个时间点从同一个人身上采集的所有样本中检测到的OTUS。定义持久性的另一种方法是根据观测值出现的次数来加权OTUs，而不是使用任意的截止值。这对于解释来自环境微生物群落的时间序列数据是很重要的，正如对西英吉利海峡海洋微生物为期11个月的研究所证明的那样。尽管在每个时间点上只检测到0.5%观察到的OTU，但这代表了生成的读取的一半，并且揭示了持久核心由大量的群落成员组成。持久性和短暂性可以被视为类似于优势和稀有的概念。在空间上排列丰度曲线以评估优势度可能在数学上与在时间上评估持久性的曲线一致。将模型应用于物种持久性分布(而不是物种多度分布)将提供一个定量框架，用于识别常规生物的核心微生物群。
连通性：微生物互作
核心微生物群的概念也可以包括关于OTU假定的或证实的相互作用的信息。许多微生物学家和生态学家一致认为，一个群落是由一个区域内相互作用的物种组成的。这种鉴定是很重要的，因为任何基于DNA的序列分析都可以检测到无活性、死亡或暂时的OTUs。因此，通过连通性鉴定核心微生物群，如果没有生物相互作用的迹象，则省略分类群(图1E)。基于连通性的核心定义将包括在微生物组内具有假设的相互作用的微生物(揭示一个区域的微生物群落)，但也在微生物组间共享(揭示相似栖息地的核心微生物组)。对此需要注意的是，一些关于缺乏连通性的预测是有缺陷的，因为可能存在应用于生态系统的方法未检测到的生物联系。
网络分析可以生成关于交互OTU的假设。网络在微生物生态学文献中越来越受欢迎，并且它们是微生物生态学工作流程中的标准，例如QIIME。网络分析有许多选项，包括一些从其他学科借用的选项。例如，将来自神经网络分析的自组织图应用于酸性矿山排水微生物群落，以了解强环境约束是否限制核苷酸组成。专门为微生物群落设计的网络分析较少，但一个例子是局部相似性分析(LSA)，它是为了解海洋细菌群落的长期动态而创建的。LSA的两个优点是:(1)它使用了一个相关统计量，以适应otu之间的非线性关系，(2)可以纳入时间成分。这些对于揭示不一定是直接或瞬时的关系很重要，例如，争夺共享资源的两个种群之间的互补动态。针对微生物生态学问题进行严格的网络分析，并能够处理大型组学微生物数据集，这对于理解核心微生物群成员之间连通性的作用至关重要。在预测和管理整个系统的核心微生物群时，微生物群落内相互作用的数量或强度可能比otu的身份更具信息性。Gardner与 Ashby（1970)的经典工作表明，系统内的相互作用比例调节稳定性，但随着系统变得更大(更可能的相互作用)，在超过“临界”相互作用比例后，它可能会突然变得不稳定。这将是一个有趣的概念，从昆虫肠道或酸性矿井排水群落到不同的哺乳动物肠道或热带土壤群落用不同复杂程度的微生物群进行测试。
核心微生物群的所有这些定义都伴随着许多警告。实质性灵活性的一个来源是OTU定义。基于序列的OTU定义有多种比对和聚类算法，每种算法都有不同的偏差来源和方法误差容限。在许多情况下，共享otu的数量取决于序列同一性的程度或选择的分类水平。例如，如果在结构域水平定义，所有细菌群落将共享一个核心成员，相反，如果共享核心成员由99.9%的序列同一性定义，则没有两个群落将共享任何核心成员。在对14个环境栖息地的分析中，16S rRNA基因中98%、95%、92%和89%的核心序列同一性证据不足。在这项比较研究中，只有16%的otu出现在一个以上的栖息地的秩序水平。
定义OTUs的新方法可能会发现以前未检测到的核心微生物群。在最近的Meta分析中，揭示了肠道生境的核心微生物群，16S序列首先被翻译成五聚体频率以降低复杂性，然后这些频率通过主成分方法进行分析，并在排序空间中进行聚类以定义OTUs。通过将这种方法与16S rRNA基因系统发育分析进行比较，作者发现他们可以重建预期的多样性。他们的结果表明，使用多种方法来定义OTUs有助于探索核心微生物群。一个重大的挑战是决定哪种统计方法是最合适和最有生物学意义的。
揭露核心还有另外的注意事项。将每个OTU分类单元分配给一个分类单元会引入偏差，但随着每个测序计划的进行，数据库变得更加全面，这是由针对系统发育上代表性不足的微生物进行测序的项目(例如GEBA；http://www . jgi . doe . gov/programs/GEBA/index . html)。微生物研究技术会影响对核心的描述。以基于聚合酶链反应的测序为例，每次观察的reads、引物和测序区的选择以及测序深度将影响对核心的感知。最后，重复势在必行。如果在所有重复中没有一致检测到OTU，则不应将其包含在核心中。应该注意最好地理解每个偏差的来源，并相应地解释结果。定义核心的另一种方法是基于一组始终不存在而不是存在于微生物组或栖息地样本中的OTU。检测技术总是会限制对缺失数据的解释，因为缺失不能与存在但低于检测极限的OTU相区分。然而，随着技术的进步，群落的饱和度将会提高，对无遗漏地对不太复杂的微生物群进行采样的能力的信心可能会促进对共有缺失的评估。将功能性分析(功能性宏基因组学和基于芯片的分析)、过程分析(转录组学、蛋白质组学、代谢组学)和组学支持的分析(基因枪宏基因组学或16S rRNA基因测序)结合起来，将加深我们对共享的现有和缺失OTUs的重要性的理解。