结肠炎治疗后抗生素依赖与肠道微生物的关系|微生物专题
发表期刊：Gastroenterology
影响因子：17
关键词：慢性炎症性肠病，肠道微生物，宏基因组，细菌耐药性
发表时间：2020
溃疡性结肠炎患者在全直肠切除术和回肠贮袋肛管吻合术（IPAA，建立一个连接到肛门的正常小肠贮存袋）后易发生慢性肠炎，需接受抗生素治疗。复发患者可能形成抗生素依赖性，需要重复或长期抗生素治疗。本研究主要为了调查与抗生素治疗、抗生素依赖相关的微生物因素，探索为什么有些病人在停用抗生素后容易复发，并揭示其肠道微生物群中存在的抗生素耐药性机制。
选49名接受过IPAA手术的患者，收集在抗生素治疗或没有抗生素治疗期间的粪便样本(n = 234)，进行宏基因组测序分析，从粪便样本中分离出细菌菌株并评估它们对环丙沙星的耐药性和诱导HT-29肠上皮细胞分泌炎性细胞因子的能力。
Abx+，抗生素治疗期样本（在抗生素治疗期间或1个月内获得的样本）;
Abx-，至少1个月未经抗生素治疗的样本;
AIEC，附着性侵袭性大肠杆菌;
CLDP，克罗恩相关性结肠袋炎;
C+M, 环丙沙星+甲硝哒唑;
FAP，家族性大肠息肉病;
FQ，氟喹诺酮类药;
IBD, 炎症性肠病;
IEC,肠上皮细胞;
PDAI, 疾病活动指数;
UC, 溃疡性结肠炎
IPAA，回肠贮袋肛管吻合术
宏基因组
一、治疗方案和研究样本采集
PAA手术后患者均由相同的内科医生进行抗生素治疗，对首发患者进行2周疗程的抗生素治疗（环丙沙星500毫克一天两次，甲硝唑500毫克一天两次）。如果在抗生素疗程后不到3个月出现复发症状，下一个疗程包括重复使用全剂量环丙沙星和甲硝唑2周，并在接下来的2周使用一半剂量。如果第二个疗程后出现部分缓解或症状迅速复发，下一个疗程包括长期减少剂量。抗生素依赖的患者在更长时间内保持最低的抗生素剂量。患者分为正常结肠袋, 急性复发性结肠袋炎, 慢性结肠炎和克罗恩相关性结肠袋炎（CLDP）。在每3个月的门诊就诊或患者出现炎症时采集粪便样本，并测定相关指标。
在完成4周以上抗生素治疗的慢性结肠炎/CLDP患者中，89% 患者复发，3个月内需要额外的抗生素治疗，对慢性结肠袋炎/CLDP患者（图1B）的连续样本对进行分析，其中一组接受抗生素治疗，另一组未接受抗生素治疗，结果显示钙保护蛋白中位数从537降至321 mg/g（40%）。
二、研究抗生素对肠道微生物组的多样性的影响
为了比较正常样本与患者在微生物多样性和丰富性的差别及影响因素，研究从粪便样本中提取DNA进行宏基因组测序。然后进行生物信息学分析，计算细菌的丰富性和多样性。结果发现抗生素和结肠袋炎都影响微生物多样性和丰富性，然后作者建立了一个包含多种物种丰富度预测因子的广义线性混合模型，模型显示，疾病类型、最后一次使用抗生素后的时间和累积抗生素治疗时间均是微生物物种丰富度下降的重要原因，而益生菌和生物治疗则倾向于与物种丰富度的增加有关。
接下来，作者比较了结肠袋炎和正常结肠袋患者的肠道微生物群组，为了避免抗生素干扰，排除了过去6个月内接受抗生素治疗的样本，结果也发现与正常样本相比，结肠袋炎患者的微生物物种多样性中位数较低。
然后对抗生素的使用情况造成的影响进行探究，根据最后一次使用抗生素的时间对样本进行分组，发现抗生素治疗后1个月以内的样本与治疗后大于1个月的样本相比，其多样性较低，结果与预期一致，最后一次抗生素剂量后的时间对微生物的多样性有影响，但在停用抗生素后，这种效果会随着时间的推移而减弱，抗生素治疗结束超过180天后，多样性已恢复到Abx- 水平。
综上，抗生素和结肠炎症的历史对肠道微生物组的多样性都有不利的影响。值得注意的是，不同的抗生素治疗方案(环丙沙星、甲硝唑或两者的结合)对细菌多样性的影响具有有所区别，对于长期使用抗生素的病人，累积抗生素对细菌多样性或丰富度的影响可以忽略不计。
三、研究长期抗生素治疗对微生物组成的影响
接着作者证明了抗生素治疗对微生物组成的影响。分离经过抗生素处理的样品与未经过处理的样品的微生物群落，然后进行物种分类学分析，结果发现Escherichia, Pantoea和Enterococcus在抗生素治疗期间显著增加，而梭菌目几种微生物(例如Clostridium perfringens 和 Ruminococcus gnavus)在使用抗生素期间显著减少。
四、耐药机制的探究
C+M治疗是结肠炎患者最多的抗生素治疗方法（占比约79%），因此，作者对这些患者的宏基因组结果进行研究，并从序列数据中推断出其微生物群落的耐药谱。作者分析了对氟喹诺酮类药物（FQ）最常见的耐药机制——药物靶基因中的所有点突变。方法是从宏基因组组装结果中得到药物靶基因Gyr/Par（gyrA，parC，parC, parE），使用BLASTP在NCBI RefSeq检索对基因进行分类注释。对于每一个鉴定出Gyr/Par同源细菌属，NCBI-protein数据库的参考物种并与宏基因组组装的Gyr/Par进行多氨基酸序列比对，对FQ耐药决定区进行检测，以确定不同分类群之间的氨基酸置换情况，并确定其抗性或敏感性。
结果检测到了益生菌(如Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Bififidobacterium longum，Bififidobacterium animalis)以及一些潜在的病原体(Klebsiella pneumoniae, Streptococcus gallolyticus, Bacteroides fragilis)的FQ耐药突变。
此外，基于微生物组抗性情况得到的随机森林分类器，区分抗生素治疗期组样本和无抗生素组样本的性能很高(AUC=0.91)，优于仅基于物种分类学的分类器(AUC=0.81)。
接着，作者对耐药性预测的可信度进行验证，从12名接受和不接受环丙沙星治疗的患者中分离出17株 大肠杆菌、粪大肠杆菌和粪大肠杆菌，并使用标准圆盘扩散分析法验证其基于序列的耐药性预测的准确性。试验中证实了10个（共11个）预计耐药的测试菌株确实在临床上对环丙沙星耐药，而6个预计易感的菌株中有5个是易感或中等耐药。
以上数据表明，持续的C+M抗生素治疗会产生一个具有高FQ抗性的并由几个兼性厌氧菌属主导的微生物群。
作者根据最后一次抗生素治疗所经过的时间对样本进行分组，抗生素治疗组微生物中的抗性基因比例比停止治疗组增加了30%，在1到6个月没有使用抗生素的样本和那些超过6个月没有使用抗生素的样本中没有差异，说明大多数耐抗生素基因的会富集富集，但在治疗停止后的第一个月会迅速减少。
五、抗生素治疗对细菌密度的影响
广谱抗生素治疗结肠袋炎的临床疗效的一个可能的解释是，它们减少了袋中细菌细胞的总数，从而减少了对细菌源性抗原的暴露。为了评估细菌密度，作者使用了宏基因组数据中细菌与非细菌(来自人类宿主+病毒)的序列比率（B/[H+V] ratio）。
接着作者验证了qPCR与宏基因组推断的细菌密度之间的一致性，用B/(H+V)和基于qPCR的细菌密度绘制了11份患者样本的相关性分析，发现qPCR 和 B/(H+V) 比例有着很强的相关性，表明宏基因组数据可以代表患者粪便样本中的细菌密度。
然后作者使用B / (H+V)比值比较不同分组间的细菌密度，发现抗生素治疗期比无抗生素组样本低1.9倍。
此外，Spearman相关性分析结果表明具有较高物种多样性的微生物群落与较高的细菌密度有关。
与正常样本相比，结肠患者细菌密度较低，这可能反映了抗生素的使用情况及结肠炎症都会降低细菌密度。
这可能反映了抗生素的使用和结肠袋炎症都能降低细菌密度，证明长期的抗生素治疗只能适度地降低细菌密度，而且不太可能减少细菌源性抗原的暴露。
六、抗生素处理对肠道微生物群致病性的影响
对抗生素疗效可能是它们选择了对抗炎症细菌。在抗生素治疗期间增加的细菌属通常被认为是条件致病菌，因此作者假设，在成功的治疗过程中出现的耐药菌株将是相对良性的(即不会编码促进肠道炎症的毒力因子)。为了验证这一假设，作者建立了一个细菌毒力因子和毒素数据库，并鉴定了所有已知可破坏哺乳动物肠道上皮或增加肠道通透性的毒素编码基因，然后筛选宏基因组，在样本里对基因中进行定量。
毒力因子分析显示，所有样品中均未发现毒素基因，其中3个样品中出现艰难梭菌毒素(丰度极低)。已知的大肠杆菌和肠球菌毒力因子在抗生素治疗期间均未显著富集，且总体存在率极低，与预期一致。
接下来，研究测试了选定的粪便分离物刺激炎症细胞因子白介素-8和GROa (CXCL1)的分泌的能力。测试的所有分离株，包括对环丙沙星高度耐药的分离株，都通过IEC诱导非常低的细胞因子分泌。几乎所有分离株的分泌物水平甚至低于共生实验室大肠杆菌菌株诱导的水平。相比之下，AIEC株LF82诱导IECs分泌非常高的炎性细胞因子。与治疗过程中缺乏肠道毒力因子不同，3例患者在停药后的5份样本中同时检测了粪肠金属蛋白酶明胶酶(gelE29)和胞溶素肠毒素(cylAB30)基因及高水平(1405-4965 ug/g)的钙保护素。
七、停止使用抗生素的对患者影响
抗生素治疗的局限性之一是患者可能会对抗生素产生依赖，在治疗停止后迅速复发。作者推测，在抗生素治疗过程中，耐药菌群和抗生素的结合，阻止了外源细菌的定植，一旦停止治疗，定植抵抗力降低，结肠袋可能被多种炎症特征细菌入侵。因此，作者研究了在停用抗生素后患者样本中存在哪些细菌，并对非肠道细菌(口腔细菌)或条件致病菌进行了定量分析，这些细菌的相对丰度在停止治疗后显著高于治疗期间。此外发现在多个样本的治疗过程中持续占主导地位的序列以前都与肠道疾病有关，其中一些与肠外感染和多药耐药有关。一旦治疗停止，所有的大肠杆菌都低于检测水平或者被另一种FQ易感的大肠杆菌所取代。
抗生素治疗减少了与疾病相关的细菌，但也减少了如粪杆菌等有益的菌。抗生素敏感患者的微生物群以兼性厌氧菌属（大肠埃希菌、肠球菌和链球菌）为主，药物靶基因中有多个环丙沙星耐药突变，并证实耐药。然而，这些菌株的毒力较低，且不诱导上皮细胞分泌炎性细胞因子。停止使用抗生素后，患者的微生物组成突然发生变化，口腔和疾病相关细菌大量繁殖。抗生素治疗还使得带有多药耐药基因座的菌株得到了富集，编码产生耐药性酶。
结肠炎的抗生素治疗效果可能是由于建立了耐抗生素的微生物群，从而在一定程度上抵抗促炎症细菌的定植，但为了避免发展为抗生素依赖性疾病及其后果，如果停止了长期的抗生素治疗，患者应该采取干预措施，防止更多的致病性和侵入性细菌快速定植（例如短期交替使用不同抗生素，适当的益生菌，或粪便微生物移植）。综上所述，目前的抗生素治疗方案应进行重新评估，为患者提供一种合理、长期、有效和安全的治疗方法。
参考文献
Vadim Dubinsky et al. Predominantly Antibiotic-resistant Intestinal Microbiome Persists in Patients With Pouchitis Who Respond to Antibiotic Therapy.Gastroenterology. October 2019.