用户文章：PNAS-单细胞测序揭示哮喘加重小鼠肺部免疫细胞特征 | 单细胞专题

标题：Single-cell transcriptomic analysis reveals the immune landscape of lung in steroid-resistantasthma exacerbation

题目：scRNA-seq揭示小鼠类固醇抗性哮喘加重模型肺部免疫细胞特征

发表时间：2021年1月

发表期刊：PNAS

影响因子：9.58

研究团队：郑州大学医学科学院——李付广教授和杨明教授研究团队

摘要

过度的气道高反应性（AHR）和炎症是哮喘的主要特征，而脂多糖（LPS）暴露与疾病的严重程度和类固醇耐药性相关。为了研究哮喘加重的潜在机制，研究者在屋尘螨（HDM）诱导的哮喘模型背景下建立了LPS诱导的类固醇抗性小鼠哮喘恶化模型，然后通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对肺部的免疫细胞进行分析。基于分子和功能特性共聚类并鉴定到了20个免疫细胞clusters，其中嗜碱性细胞，2型先天性淋巴样细胞（ILC2）和CD8⁺记忆T细胞是IL-4和IL-13（二者的表达与地塞米松耐药相关）的特定细胞来源，IL-13报告基因小鼠证实了这些细胞会产生IL-13，中和IL-13可以消除HDM/LPS诱导的气道高反应性、气道炎症和黏液分泌过多。此外，使用IPA分析确定了调节嗜碱性粒细胞、ILC2和CD8⁺记忆T细胞激活的通路和上游调控子。本项研究为进一步加深了解哮喘加重期间免疫图谱提供了重要参考。

背景

哮喘加重是哮喘患者住院的主要原因，引起哮喘加重的因素包括屋尘螨(HDM)、花粉、呼吸道感染、香烟烟雾和污染物。大量证据表明，肺部先天免疫反应和潜在的2型免疫微环境之间的相互作用改变了炎症后遗症并引发哮喘加重。2型细胞因子调控的气道炎症和过敏原暴露引起的哮喘临床特征可以被以糖皮质激素和β2激动剂为主的治疗缓解。然而有一点越来越明确，肺部异常激活的免疫反应与哮喘加重密切相关，并降低糖皮质激素治疗效果。

HDM过敏原是诱发哮喘患者过敏性肺部炎症的主要原因之一，来自HDM的蛋白酶通过促进异常的先天和适应性免疫反应参与哮喘发病，脂多糖(LPS)通常来源于革兰氏阴性菌的细胞膜和环境污染，其含量水平与哮喘的严重程度和肺功能下降直接相关。过敏性哮喘和哮喘加重相关临床研究和实验模型表明，LPS和过敏原可能在疾病加重中发挥重要作用，使糖皮质激素应答表型向糖皮质激素无应答表型倾斜。

哮喘加重发作的特征是气道中浸润的嗜酸性粒细胞、巨噬细胞/单核细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞引起的炎症加剧。值得注意的是，中性粒细胞招募是糖皮质激素治疗反应不良患者急性加重的突出特征之一，中性粒细胞渗入气道表明宿主抵抗感染的先天防御通路已被激活。尽管有一些证据表明呼吸道感染和过敏原暴露参与哮喘加重的发展，但在哮喘加重期间，中性粒细胞浸润、糖皮质激素耐受和气道阻塞发病机制之间复杂的分子网络仍不清楚。近年来，针对哮喘的免疫疗法大大提高了治疗效果，然而，免疫治疗疗效在不同哮喘患者或亚型中并不一致。因此发现特定的biomarker和明确的、特定的分子调控网络，不仅可以预测治疗效果，而且可以揭示宿主免疫细胞之间复杂的相互作用。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)最近被用于揭示异质细胞的发育和相互作用，并在全基因组范围内检测大量基因的表达，这使我们能够以前所未有的分辨率来揭示高度复杂的慢性疾病组织中的微环境。为了阐明肺内免疫细胞浸润的复杂性，研究人员建立了HDM和LPS诱导的小鼠哮喘加重模型，从肺中分离免疫细胞进行scRNA-seq，共鉴定了20种主要免疫细胞类群，对这些细胞的特征基因进行分析，发现参与类固醇抵抗的IL-4和IL-13主要由嗜碱性粒细胞、ILC2和CD8⁺记忆细胞表达。这一前所未有的数据对于研究肺中的适应性和先天免疫细胞的特征以及为哮喘加重患者开发有效治疗策略是至关重要的。

结果

小鼠哮喘加重模型中LPS诱导类固醇耐受、气道高反应性和气道炎症

将BALB/c小鼠致敏暴露于HDM建立HDM诱导的AAD（过敏性呼吸道疾病），对照组为生理盐水处理。在第20天和第22天注射LPS以诱导哮喘加重，LPS给药前3 h给予DEX（地塞米松）或PBS（图1A）。地塞米松治疗可显著抑制HDM诱导的肺AAD特征（图1B），与HDM或LPS单独组相比，HDM/LPS组AHR明显加重和延长，巨噬细胞、中性粒细胞浸润、黏液高分泌和炎症反应升高，HDM/LPS组中LPS处理对HDM诱导的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润水平无影响，地塞米松没有缓解HDM/LPS诱导加重的AHR，BALF中浸润的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞增加（图1C）。病理检测发现地塞米松没有降低嗜酸性粒细胞和炎症评分，但小幅度降低粘液分泌细胞数量（图1D、E）

图1：实验设计及不同组小鼠表型变化

肺免疫细胞单细胞测序

选择三组样本：生理盐水处理组（SAL）、HDM/LPS+vehicle组（VEH）和HDM/LPS+地塞米松组（DEX），每组6个小鼠肺混合后FACS分选CD45⁺细胞做单细胞测序，共鉴定到20种细胞类型（图2A、B）。

图2：单细胞测序结果

CD11b⁺巨噬细胞、多个树突状细胞(DCs)亚群和ILC2可能与类固醇耐药AHR和气道炎症相关

三组样本检测到1769个差异转录本（FC>2&p<0.05），SAL, VEH和DEX分别检测到848、1335和1379个高可变基因（图3A）。VEH组中LPS诱导导致淋巴细胞的数量轻微下降，而巨噬细胞和CD103^- DCs数量略有上升。地塞米松治疗使得很多细胞数量增加,包括CD4⁺ T细胞、CD19⁺ B细胞、中性粒细胞、三个单核细胞clusters和Tregs，但CD11b^-巨噬细胞减少（图3B、C）。

使用ClueGO和ShinyGO分别对VEH组和DEX组间CD11b⁺巨噬细胞、CD103^-DCs、CD8^- 浆DCs (pDCs)、CD8^- DCs和ILC2的共同高可变基因做KEGG富集分析并分析调控高可变基因的TF，数据表明多种通路被激活从而驱动炎症反应加剧哮喘加重。这些相互作用反应了细胞响应的异质性和复杂的细胞间信号传导。通过观察细胞反应特性和临床数据表明，ILC2可能是哮喘加重的关键环节。

图3：单细胞测序高可变基因和不同组细胞比例变化

IL-4和IL-13在嗜碱性粒细胞、ILC2和CD8⁺记忆T细胞表达

已知多种促炎细胞因子在哮喘的发病机制和哮喘加重中起关键作用，因此，研究人员评估了与Th1、Th2、ILC2s、抗感染反应和气道重塑相关的经典细胞因子在不同细胞clusters中的表达。SAL、VEH和DEX三组样本中几乎所有clusters均高表达CCL5，但其受地塞米松治疗的影响不显著。高表达细胞因子还包括因子IL-4、IL-13、IFNγ等，其中L-4和IL-13是驱动2型反应的关键细胞因子。地塞米松治疗没有抑制CD8^-DCs和嗜碱性细胞中IL-4的表达，相反，它促进Ly6C⁺和Ly6C^-单核细胞、Treg和CD103-DC产生这种细胞因子。IL-13在CD8⁺记忆T细胞、ILC2和嗜碱性粒细胞中存在表达差异，且这种表达对糖皮质激素不敏感，而且地塞米松治疗能轻微促进了CD8⁺记忆T细胞中IL-13的表达。IFNγ可在NK1.1⁺NK细胞、CD11b⁺巨噬细胞和CD8⁺记忆T细胞中表达，且表达具有类固醇抵抗性。Ly6C⁺单核细胞、Ly6C^-单核细胞、CD103^-DCs和CD8^-DCs表达CCL24，一种嗜酸性趋化因子。IL-1β在CD11b-巨噬细胞、CD8⁺记忆T细胞、CD103^-和CD8^-DCs高表达且表达具有类固醇耐受性。IL-18主要在Ly6C^-单核细胞、CD11b⁺巨噬细胞和CD8^-DCs表达，IL-10主要在Ly6C^-单核细胞、CD11b⁺巨噬细胞、CD103^-DCs和CD8^-DCs中表达。Treg也表达IL-10，但表达水平明显较低。多种关键炎症因子，例如IL-1α、IL-2、IL-6、IL-12a、CCL2、TNF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3在多种免疫细胞中表达。其他细胞因子包括IL-3、IL-5、IL-17a、IL-25、IL-33和TSLP在SAL、VEH和DEX各组中的表达均未检测到（图4A）。

ClueGO分析发现上述细胞因子和趋化因子具有很多功能类别，富集基因最多的功能涉及白细胞分化的正调控、STAT蛋白酪氨酸磷酸化的正调控等（图4B）。

图4: 炎症因子表达展示（Dotplot图）；检测到的主要细胞因子和趋化因子GO功能饼图

L-13调节HDM/LPS诱导的类固醇耐药AHR和气道炎症

通过构建IL-13-tdTomato-reporter小鼠检测IL-13细胞来源，发现CD8⁺ T细胞、ILC2和嗜碱性粒细胞可以产生IL-13，而CD4⁺T细胞产生的IL-13几乎可以忽略（图5）

图5：DM/LPS诱导的哮喘加重期间，嗜碱性粒细胞，ILC2和CD8⁺T细胞合成IL-13比较

AAD模型构建成功后使用anti-IL-13单抗中和IL-13（图6A），发现与同型对照相比，抗IL-13单抗在VEH组和DEX组均可消除AHR（图6B），IL-13中和反应显著抑制了两组样本BALF中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的浸润。VEH组和DEX组中杯状细胞增生，粘液分泌过多、嗜酸性粒细胞数量增加和肺组织炎症评分升高被抗IL-13单抗治疗逆转（图6C、D）。

总体而言，这些数据表明IL-13对调节LPS诱导的的类固醇耐药AHR和气道炎症至关重要，而且在脂多糖诱导的哮喘加重期间，该细胞因子主要由CD8⁺ T细胞、ILC2和嗜碱性粒细胞产生。

图6：中和IL-13可减少HDM/LPS诱导的类固醇耐药模型AHR，粘液增生和气道炎症

哮喘加重期嗜碱性粒细胞、ILC2和CD8⁺记忆T细胞的典型通路和上游调控因子上调

使用IPA在“Canonical Pathway” 和“Upstream Regulator”两个角度分析哮喘加重期嗜碱性粒细胞、ILC2和CD8⁺记忆T细胞内在分子网络，Z值最高的通路包括“EIF2 Signaling”、 followed by “Oxidative Phosphorylation”和 “Signaling by Rho Family GTPase”（图7A）。三个细胞clusters中共同出现的通路包括stress-related response、generation of reactive oxygen species和 cell motility，它们参与调节细胞功能和类固醇抗性。

预测到的高分上游调控子包括STK11、NFE2L2,、Hbb-b1、 IFNγ、CD38和IL-5。除了TL4（CD8⁺记忆T细胞）、TLR3/IL-1β（ILC2）和IL-4/Myc（嗜碱性粒细胞）外，大部分激活的调控子都参与到类固醇耐受。MyD88，TLR3，TLR4，EGR1，Retnlb和NF-κB只在嗜碱性粒细胞中被激活，EGFR和CHUK只在ILC2中被激活，TCF3，TCF4和SMAD3中在CD8⁺记忆T细胞中被激活。地塞米松治疗促进了CD8⁺记忆T细胞中STAT1/BCR/PPARGC1A被激活，ILC2中被激活的是IKBKG/MKNK1PITX2/CD28，嗜碱性粒细胞中被激活的是TICAM1/IFNAR（图7B）。

图7：哮喘加重期间，嗜碱性粒细胞，ILC2和CD8⁺记忆T细胞的典型途径和上游调节因子激活情况

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