琼脂糖凝胶电泳详解 | 技术专栏
1809年首次发现电泳现象。
1909年首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。
1937年创造了 Tiselius 电泳仪，首次开发蛋白质电泳。
1948 年 Wieland 和 Fischer 重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行研究。
1950 年 Durrum 用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。
1959 年 Raymond 和 Weintraub 利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳。
电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。
电泳法可分为自由电泳（无支持物）及区带电泳（有支持物）两大类。
自由电泳包括显微电泳、等电聚焦电泳，等速电泳及密度梯度电泳。
区带电泳包括滤纸电泳、薄层电泳、醋酸纤维薄膜电泳、非凝胶性支持体区带电泳、凝胶支持体区带电泳（琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶）等。
电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。
1、简介
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳的分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
2、优点
（1）电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。
（2）结构均匀，含水量大，近似自由电泳，样品扩散较自由，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
（3）透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。
（4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定，制成干膜可长期保存。
3、缺点
（1）具有比较差的机械强度，容易破碎，浓度不可以过低。
（2）容易受到细菌的污染，保存不方便，配置的时间需要临近使用的时间。
（3）琼脂糖支持层上的区带很容易扩散，电泳必须马上固定染色。
（4）比PAGE区带小，分子筛作用小。
DNA分子的大小：DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比。分子越大，摩擦阻力越大，同时大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，所以分子大的迁移慢。等量的空间结构，紧密的电泳块（超螺旋＞线性DNA）一般来说分子带的电荷量越大、直径越小，形态越接近球形，则其电泳迁移速度越快。
凝胶浓度：浓度越大，分子孔径就越小，DNA迁移率就越低，反之迁移率就大，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大，分辨率越高，但分离的DNA片段就越小。 DNA的构象：一般迁移速率超螺旋环状＞线状DNA＞单链开环。
使用的电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比，使分辨效果好所加电压不应超过5-8V/CM。
琼脂糖的种类:标准琼脂糖与低熔点琼脂糖其分辨率等各有不同。
电泳缓冲液：溶液PH值距离其等电点越远，其所带净电荷就越大，电泳速度也越大，尤其是对蛋白质等两性分子，缓冲液的PH值还会影响其电泳方向。溶液的离子强度过低，会使电导率降低，DNA不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔化，也会使DNA变性。
1、配胶
（1）胶浓度：根据样品分子大小选择合适胶浓度。
（2）电泳缓冲液：提供一定的离子强度和溶液的PH值。
50×TAE(Tris-乙酸缓冲液) | 1×TAE |
5×TBE（Tris-硼酸缓冲液） | 0.5×TBE |
10×TPE（Tris-磷酸缓冲液） | 1×TPE |
（3） 常用染料（EB、SYBR）：插入核酸结构，吸收紫外光产生荧光。
2、溶胶
（1）电泳缓冲液要和用于制胶的缓冲液一致
（2）制胶量和凝胶浓度要精确，总液体不宜超过三角锥形瓶50%容量。
（3）在微波炉里加热时不可放置过久，加热时胶液剧烈沸腾发泡，要停止加热。
（4）必须保证琼脂糖完全溶解，否则胶图会模糊不清。
（5）胶凝固的时间需半小时以上。
（6）染料含有致癌物质，注意戴好手套。
3、制胶板
制胶板：根据待检测样本数量，体积大小以及后续实验用于检测还是回收，来选用合适的胶板大小，样本孔大小和胶厚度。
4、上样/制样
（1）制样：样本与适当体积的凝胶上样缓冲液混匀。
（2）上样：凝胶上样缓冲液：6X loading buffer/10X loading buffer。
（3）作用：含有溴酚蓝，使样本带颜色，起指示作用，指示样本迁移过程；含有蔗糖和甘油，增加样本密度，使样本沉入样品口底部。
（4）DNA marker：主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题，通过其大小可以粗略估算样品DNA分子量的大小。
5、电泳
琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。
电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。
6、检测
凝胶成像仪：主要用于蛋白质、核酸凝胶成像及分析，系统提供白光和紫外光以及蓝光光源进行拍摄凝胶，由系统自带的图像捕捉软件捕捉拍摄图像，然后由系统自带的图像分析软件对拍摄的图像进行分析。
1、DNA条带模糊，拖尾
（1）DNA 降解。避免核酸酶污染。
（2）DNA 上样量过多。减少凝胶中 DNA 上样量。
（3）电泳缓冲液陈旧: 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。
（4）电泳条件不合适。电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃ ,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
（5）DNA 样含盐过高。电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
（6）有蛋白污染。电泳前抽提去除蛋白。
（7）DNA 变性。电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
2、DNA 条带淡弱或无 DNA 带
（1）DNA 的上样量不够：增加 DNA 的上样量。
（2）DNA 降解：避免 DNA 的核酸酶污染。
（3）DNA 走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
（4）分子大小相近的 DNA 带不易分辨。增加电泳时间，使用正确的凝胶浓度。
（5）DNA 变性：电泳前请勿高温加热 DNA 链，用 20mM NaCl Buffer稀释DNA 。
（6）DNA 链巨大，常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上分析。
3、DNA MARKER 条带扭曲
（1）配制凝胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的。使用同时配制的缓冲液。电泳时缓冲液高过液面1－2mm 即可。
（2）电泳时电压过高。可以在电泳前 15 分钟用较低电压 (3V/cm)，等条带出孔后，再调电压。
（3）尽量慢慢加样，等样品自然沉降后再加电压。
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