双特异性抗体：on-target off-tumor毒性及克服策略 | 免疫学专题

CD3XTAAs双特异性抗体，其中肿瘤相关抗原（TAAs）多选用肿瘤细胞膜蛋白，需在肿瘤高表达， 在健康细胞不表达，否则容易出现on-target off-tumor的毒性。

肿瘤抗原

膜抗原

但现实是大多数膜蛋白在肿瘤细胞和健康细胞之间是保守的。理想的TAAs是肿瘤新生抗原或者肿瘤病毒抗原，但是只局限于很少的一部分肿瘤。现在多使用的靶点是肿瘤细胞过度表达抗原（如CEA、EGFR、EpCAM和HER2），健康细胞低表达，所以还是会出现不同程度off tumor的毒性。 

 胞内抗原

癌症中一些表达差异最大的是细胞内蛋白，但是传统抗体无法进入胞内。这种细胞内蛋白质需要通过HLA I类分子递呈出来才能被识别， 这些表面肽/HLA复合物可以与肽特异性抗体或TCR分子靶向，如ImmTACs或TCR样抗体。

ImmTACs或TCR样抗体的TCR臂被增强亲和力至低nM级，以更好的识别TAAs，方便CD3臂能够更好的招募T细胞杀伤肿瘤细胞。但是TCR样CD3-双抗的主要缺点是HLA限制和肿瘤通常会下调HLA，另外依然可以发现on-target off-tumor的副作用。比如tebentafusp的临床试验发现了剂量限制毒性病例。

为了提高肿瘤的选择性和特异性，降低off tumor毒性，很多研究人员开始优化CD3抗体及TAAs的亲和力。例如，可以通过产生所谓的2：1CD3-BsAb来提高TAA的有效性，这些2：1CD3-BsAb抗体含有第二个TAA结合片段，增强和肿瘤细胞的结合，但是当TAA亲和力过高时，可以与健康细胞上表达的低水平TAA结合。另一方面，如果TAA亲和力太低，CD3-BsAb的效力就会受到损害。因此，调节TAA亲和力实现特异性和有效性之间平衡。

常用策略

前药技术

利用肿瘤微环境的特点（如低pH值，特定ECM成分，蛋白酶等）开发前药，是近年来在克服off-tumor毒性上的重要策略。

1. Probody技术

CytomX Therapeutics的Probody技术，在抗体的N端通过可酶解的linker加一个掩蔽肽（Masking peptide）。在抗体到达肿瘤微环境，可被肿瘤特异性的蛋白酶酶解去掉掩蔽肽，从而结合靶点。在食蟹猴的研究中，Probody抗体的最大耐受剂量是不加掩蔽肽的60倍。 

Probody工作原理（文献1）

2. COBRA技术

Maverick Therapeutics的COBRA^TM双抗由两个半抗体组成：

• 一个半抗体由活性的anti-CD3的单链可变区（scFv VH），通过可被MMP9酶解的linker在C端连接无活性的可变区片段(VLi)，N端连接肿瘤相关抗原抗体。
• 一个半抗体由活性的anti-CD3的单链可变区（scFv VL），通过可被MMP9酶解的linker在C端连接无活性的可变区片段(VHi)，N端连接肿瘤相关抗原抗体。

COBRA工作原理（文献2）

到了肿瘤局部，半抗体由肿瘤微环境的MMP9酶解VH与VLi，VL与VHi之间linker。暴露CD3抗体的活性片段，通过肿瘤相关抗原抗体（aTTA）识别肿瘤，CD3抗体活性片段招募T细胞并激活，发挥抗肿瘤活性。

3.半抗体+半抗体

 和Maverick Therapeutics的COBRA技术有点类似，也是两个半抗体， anti-CD3VH或者anti-CD3VL抗体一端连接靶抗原抗体，但是另外一端未加其他的遮蔽序列（如无活性的CD3或者遮蔽肽等）。进入体内CD3的可变区轻重链结合组装形成双抗。此双抗携带两个不同靶抗原单链可变区片段（scFv1和scFv2）。

 文献3

4. 罗氏的pro-FOLR1-TCB

FOLR1-TCB是在罗氏2+1 CD3XFOLR1双抗基础上，将anti-CD3抗体通过蛋白酶可裂解linker和anti-idiotypic anti-CD3相连，形成前药pro-FOLR1-TCB。

pro-FOLR1-TCB在肿瘤微环境被肿瘤的蛋白酶裂解linker释放出活性形式的FOLR1-TCB。

 pro-FOLR1-TCB（文献4）

改变CD3抗体的亲和力

对于CD3XHER2双抗，使用SPECT进行体内分布研究，显示带有高亲和力CD3的双抗，主要分布在T细胞富集区（脾脏和淋巴结），使用低亲和力CD3双抗，则更多分布在肿瘤。

CD3亲和力与双抗组织分布（文献5） 

瘤内注射CD3双特异性抗体

虽然无法完全组织CD3双抗扩散到周围组织，但是瘤内注射是一种减少on target off tumor的有效方式。虽然在超声引导下对局部非浅层肿瘤注射用药是可能的，但这种方法仍然复杂，需要多次注射。

其他方法

此外也有研究单位开发分泌双特异性抗体的细胞（STAb-T），这种细胞只有进入肿瘤微环境被激活后，才分泌双特异性抗体。

使用溶瘤病毒或者纳米颗粒等对药物进行包裹，至肿瘤局部释放，也是开发的方向。

不过这些方法都还处于早期的研究阶段。

喵评：On target off-tumor毒性局限了抗体的使用。随着肿瘤微环境的深入研究，一些前药技术开始兴起，Roche也参与其中，武田则收购了Maverick Therapeutic，获得COBRA^TM双抗技术。 

参考文献

1. Krishna R Polu & Henry B Lowman，Probody therapeutics for targeting antibodies to diseased tissue，Expert Opin. Biol. Ther. (2014) 14(8):1049-1053

2. Anand Panchal et al,COBRA™: a highly potent conditionally active T cell engager engineered for the treatment of solidtumors,MABS 2020, VOL. 12, NO. 1, e1792130 (1–11 pages)

3. Banaszek, A.; Bumm, T.G.P.; Nowotny, B.; Geis, M.; Jacob, K.; Wolfl, M.; Trebing, J.; Kucka, K.; Kouhestani, D.; Gogishvili, T.; et al. On-target restoration of a split T cell-engaging antibody for precision immunotherapy. Nat. Commun. 2019, 10, 5387

4. Geiger, M.; Stubenrauch, K.-G.; Sam, J.; Richter, W.F.; Jordan, G.; Eckmann, J.; Hage, C.; Nicolini, V.; Freimoser-Grundschober, A.; Ritter, M.; et al. Protease-activation using anti-idiotypic masks enables tumor specificity of a folate receptor 1-T cell bispecific antibody. Nat. Commun. 2020, 11

5. Mandikian, D.; Takahashi, N.; Lo, A.A.; Li, J.; Eastham-Anderson, J.; Slaga, D.; Ho, J.; Hristopoulos, M.; Clark, R.; Totpal, K.; et al. Relative Target Affinities of T-Cell-Dependent Bispecific Antibodies Determine Biodistribution in a Solid Tumor Mouse Model. Mol. Cancer Ther. 2018, 17, 776–785.

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