通过改善的低起始量样本RIP-seq方法进行表观转录组学分析

作为mRNA中丰度最高的修饰，m6A在动物mRNA中占比0.2%-0.6%。MeRIP-seq是一种在全转录组范围内定位m6A的方法。然而，这种方法需要起始量为300ug的总RNA，这就使其在疾病肿瘤方向的应用很受限。本文中，我们呈现了一种改善的m6A MeRIP-seq方法和分析准测，使其可以应用于低起始量的肿瘤样本。我们优化了m6A MeRIP-seq的关键参数，包括RNA的起始量、RNA片段化条件、抗体的选择、MeRIP清洗/洗脱条件、RNA文库构建方法、生信分析准则。由于IP条件的优化和rRNA去除后的扩增，我们可以把起始量降低到500ng。从两个肺腺癌（ADC）病人的肿瘤中，我们鉴定到了接近12，000个m6A峰，这些m6A峰有着高的信噪比。通过对同一肿瘤病人的转录组学、m6A表观遗传学和蛋白质组学的数据分析，我们发现m6A的动态变化可以影响mRNA和蛋白含量的失调。这个优化的m6A MeRIP-seq方法适用于研究样本量受限的肿瘤样本的m6A表观遗传学研究，奠定了临床背景下m6A表观遗传的动态变化和潜在机制。

表观转录组是一种基于RNA生物化学修饰的功能相关的转录组组学，它开启了研究基因表达的转录后调控之门。迄今为止，已发现超过150种RNA修饰。自1970s首次被发现以来，m6A被认为是哺乳动物mRNA中丰度最高的修饰之一。最近关于m6A定位、功能及分子机制的研究证明这种修饰是可逆动态的，参与调节RNA周期的多个步骤，包括RNA剪切、RNA衰老、pre-miRNA加工和蛋白翻译等过程。

mRNA 中M6A修饰的动态的变化已经被证明与干细胞分化、应激反应、DNA损伤修复、性别分化和生物钟周期紧密相关。此外，最近的研究发现，m6A的失调在人类癌症的发生和发展过程中发挥着至关重要的作用。M6A相关的酶，包括writers、readers、erasers,在许多肿瘤样本中都表达异常。例如，由缺氧引起的m6A去甲基化酶ALKBH5可以引起干细胞的marker基因NANOG的去甲基化，进而导致NANOG基因表达和乳腺癌干细胞的量增加。此外，ALKBH5通过增强FOXMM1基因的表达来维持胶质母细胞瘤增殖和肿瘤发生。类似地，m6A去甲基化酶FTO和甲基化转移酶3（METTL3）的致瘤功能已经分别在急性骨髓性白血病和肺癌中得到证明。

MeRIP-seq被开发用来在全转录组范围内识别m6A修饰。在人类细胞中接近7000个编码蛋白的基因中，已发现超过10，000个m6A位点。尽管最近这这项技术已经得以改进，并且已有商业化的试剂盒，但是仍然RNA的起始量量仍然需要几百微克。因为临床样本可以获得的RNA总量很少，这就使得m6A在临床样本中的研究受限。尽管m6A是动物mRNA中丰度最高的修饰，但是由于缺乏有效的方法，m6A在人类疾病，尤其是癌症中的作用还有很多未知。因此，一种低起始量m6A的测序方法有助于对癌症中M6A动态变化机制进行研究。

为了研究病人肿瘤样本中的表观转录轮廓，我们优化了m6A MeRIP-seq中的关键实验参数，包括RNA的起始量，RNA片段化条件，m6A抗体选择，MeRIP清洗/洗脱条件和RNA文库构建方法。“peak”的寻找和m6A分析方法的不同也被探索。用优化后的方法，我们用来自肺癌病人肿瘤的2ug起始的总RNA进行建库测序分析，发现了接近12，000个m6A峰,这些峰具有高的信噪比。

  结果

清洗/洗脱条件的优化

M6A MeRIP的第一步是化学片段化。在高温时，通过重排反应，m1A可以转化为m6A,为了使这种重排反应最小化，RNA片段化温度由原来的94 ˚C改为70 ˚C。由于我们旨在挑战个位数微克级别的RNA作为m6A MeRIP，因为我们用的是总RNA而不是poly（A）富集的mRNA去片段化的。RNA片段化后主峰在200nt左右而非100nt，以尽量减少损失。

目前主要有两种m6A MeRIP方法。第一种，称为方法II(图1A )，IP孵育后用低盐/高盐清洗，随后洗脱整个抗体-磁珠复合体。第二种方法，称为方法III(图1A)，用IP反应buffer清洗，m6A竞争物洗脱。这种方法在这个领域被普遍应用。为了比较这两种方法的IP效率，我们先用包含等量m6A修饰的对照RNA（Gluc）和没有修饰的RNA（CLuc）。Gluc RNA对照是在体外用20%的m6ATP和80%ATP转录而来。为了比较，我们增加了另外一种方法，称为方法I(图1A)，用IP反应液清洗和洗脱整个抗体-磁珠复合物。本研究中使用NEB品牌的m6A抗体。方法二，使用低盐/高盐清洗，产生较高的信噪比（S/N）。用洗脱的RNA进行二轮IP，产生更高的信噪比（S/N）（图1C）。我们选择方法II对来自人类肺癌细胞系A549的RNA进行m6A MeRIP测序。在片段化之前，加入0.1fmol的Gluc和CLuc RNA到32ug的A549细胞系RNA中。基于已发表的A549细胞系的m6A MeRIP实验，SETD7和GAPDH分别作为阳性和阴性对照。第一轮IP之后, Gluc/Cluc和SETD7/GAPDH的S/N接近100倍。和用纯的对照GLuc和CLuc RNA结果一致，Gluc/Cluc和SETD7/GAPDH的信噪比进一步增加，尽管产量显著减少（66%）。

图1

M6A峰的搜寻和“motif”分析准则的优化

随着全转录组范围内m6A研究的突破，2种分析准则被用于m6A峰的搜寻。第一种主要是运用最流行的“Peak calling”软件MACS，这个软件最初开发是为了CHIP-seq分析。第二种包括许多专门检测全转录组范围内的m6A位点的方法，如exomePeak , HEPeak, and MeTPeak。MeTPeak 是基于exomePeak ,和HEPeak开发的，我们用MeTPeak和MACS对A549和HepG2两个细胞系数据库进行分析比较。与MeTPeak比，MACS可以识别更多的m6A峰。MeTPeak识别的大部分peak也可以被MACS识别。MeTPeak和MACS都对测序深度比较敏感，但是MeTPeak可以在较低的测序深度时就可以达到平台期（图2B）。这两种方法种识别的m6A 峰中的 motif”RRACH”是一致的。然而，与MACS比，MeTPeak识别的峰的motif更接近于顶峰（图2C和2D）。MACS识别的峰倾向于在转录起始位点区域（TSS）富集。MeTPeak在识别相邻的外显子区域更准确。综合考虑，本研究选择MeTPeak进行后续的分析。

 图2

M6A抗体影响m6A MeRIP效率

已经优化了m6A MeRIP方法和数据分析准则，接下来我们探索m6A抗体的准确性。我们选择了来自SySy、NEB和Millipore的三种m6A抗体。用32ug的来自A549细胞系的RNA，在RNA片段化之前加入对照RNA Gluc和Cluc。与NEB和Millipore比，SySy抗体产生两倍量的IP产物。三种抗体中，GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH的信噪比都比较高，尤其是NEB和Millipore，它们可以产生的信噪比超过100（图3A）。

比较了一些商业化的RNA测序试剂盒，我们选择了SMARTer Stranded Total RNA-Seq （KitPico Input Mammalian，Takara/Clontech）。该试剂盒在转录组后，使用人特异的核糖体探针去除核糖体的cDNA。

 这种方法在片段化之前没有去除rRNA或者富集poly（A）RNA，可以最大程度地减少低起始量RNA的损失。用此试剂盒，我们成功地构建了这三种抗体的IP和Input样本的文库。与RT-qPCR结果一致，使用这三种抗体构建的文库测序结果中SETD7的m6A的S/N非常近似（图3B）。每个文库中大约13，000个m6A峰可以被检测到，其中有约60%的峰是重叠的（图3C）。三种抗体的平均测序深度为20M，就可以使鉴定到的峰的数量达到平台期（图3D）。m6A峰主要在终止密码子附近富集。在5个不重叠的基因组区域内，这三种抗体鉴定到的m6A的占比也类似，且m6A都是在终止密码子附近富集（图3F）。此外，用NEB和Millipore抗体IP到的m6A峰的motif是“GGAC”（图3G）。

图3

用来自A549细胞系的低起始量RNA进行m6A MeRIP建库测序

我们用Millipore抗体检测不同起始量（32ug、12ug、6ug、2ug、1ug和0.5ug）的RNA的m6A MeRIP效率。随着起始量的减少，SETD7/GAPDH的S/N逐渐减少。增加RNA起始量可以增加检测的m6A峰的数目，且除了0.5ug起始之外，其他起始量的样本测序深度为20M时即可达到检测峰数目的平台期，但是0.5ug起始的样本，测序深度为10M时即可达到检测峰数目的平台期（图4）。比较32ug、12ug、6ug、2ug、1ug起始的样本，RNA起始量越高，检测的唯一的m6A峰数目越多（图4B）。此外，2ug和32ug起始的样本中重叠的m6A基因的表达水平显著高于32ug起始的样本中的唯一的m6A峰的基因的表达水平（图4C），这意味着样本起始量越高，m6A MeRIP-seq可以鉴定到的m6A峰的丰度就越小。2ug起始的样本与其他起始量的样本比，m6A峰都是在终止密码子附近富集，主要的motif序列也一致（图4D）。

我们也比较了不同的抗体起始量的影响，发现抗体起始量越低，S/N越高，但是RNA的产量也越低。

 图4

肺癌肿瘤细胞中m6A的表观转录组

已经用人细胞系证明了低起始量样本m6A MeRIP-seq的准确性，因此我们用这种方法来探究两个ADC病人（tumor 1和tumor 2）的m6A表观转录组学。为了增加MeRIP实验的多样性，本实验中加入外源RNA。因为细菌K-12中m6A修饰已经被检测，因此我们在片段化之前加入9ng的K-12 RNA到2ug的病人肿瘤RNA中。我们在每个样本中检测到了12，000个m6A峰，有接近60%的m6A峰在两个样本中都可以被检测到。M6A峰主要在终止密码子和TSS位点附近富集（图5A），且motif序列也一致（图5B）。tumor1样本中可以检测到599个峰（554个基因），tumor 2样本中可以鉴定到465个峰（417个基因）（图5C）。为了进一步探索m6A在蛋白水平上的影响，我们对两个肿瘤样本进行了MS分析。在选择的953个基因中，209个可以被MS检测到。对在mRNA和蛋白水平上相对高表达的基因进行筛选，我们把范围缩小到45个基因，其中18个基因两个样本之间会有表达差异（图5D）。如SLC2A1，它的mRNA表达量在两个样本间是近似的，但是蛋白水平tumor1是tumor2的1.9倍（图5E）。用人源肿瘤移植样本进行蛋白印记分析也证实了这种差异（图5F）。tumor1中SLC2A1 终止密码子附近的m6A水平是tumor2中的2倍（图5E）。因此我们推断mRNA和蛋白水平之间的差异可能是与m6A水平的动态变化有关。为了验证这种假设，我们用2个不同的siRNAs对A549细胞系中的METTL3进行了敲除,敲除效率用RT-qPCR和western  blot进行了验证(图5G和5H）。敲除后，SLC2A1 mRNA的表达量变化不大，但是蛋白含量显著下降（图5H）。已报到METTL3的非催化区域可以促进EGFR蛋白的翻译，因此我们验证METTL3是否可以增强SLC2A1的翻译效率。在内源性METTL3敲除细胞系中，全长但是无催化活性的外源性METTL3可以提高SLC2A1的蛋白表达量（图5I和5J），表明m6A甲基化可以促进SLC2A1的翻译效率。

图5

参考文献

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