PNAS：单细胞测序揭示新生儿卵巢中抑制转录新机制 | 单细胞专题

论文标题：Single-cell sequencing reveals suppressive transcriptional programs regulated by MIS/AMH in neonatal ovaries

刊登日期：2021年05月

发表杂志：PNAS

影响因子：10.8

研究机构：马萨诸塞州总医院儿科外科研究实验室、哈佛医学院

1概况与摘要：

卵泡是由一个卵母细胞和其周围许多小型卵泡细胞组成，人类和啮齿类动物胎儿卵母细胞的数目在出生前达到了顶峰。根据卵泡发育过程的形态和功能变化，可分为原始卵泡、生长卵泡（初级、次级、三级（窦卵泡，出现了卵泡腔））和成熟卵泡三个阶段。

当生殖细胞囊肿破裂、前颗粒细胞进入即形成原始卵泡，其特征是一层扁平的颗粒细胞包围着单个卵母细胞。对于啮齿动物而言，原始卵泡的形成一般发生在出生后PND1（第1天）和PND3之间。

MIS主要由出生后雌性的次级和窦前期卵泡的颗粒细胞产生，并通过其特异性受体MISR2发挥作用，MISR2在所有类型的颗粒细胞和卵巢表面上皮细胞（OSE）中表达。有研究发现，外源性MIS处理小鼠可抑制卵泡发育和排卵。啮齿动物和人类中也证明了生长卵泡产生的MIS能够负反馈抑制原始卵泡激活。

为了了解MIS抑制第一波卵泡激活的机制，作者对出生后小鼠和大鼠进行了6天MIS处理，并对整个卵巢进行单细胞RNA测序。

（PND6：全部生殖细胞囊肿破裂完成，形成大量原始卵泡，并且原始卵泡开始进入发育为初级卵泡和次级卵泡的阶段）。

结果发现与对照组相比，MIS处理组的影响如下：

1、抑制了卵巢颗粒细胞、卵巢表面上皮和基质细胞的增殖，并发现了一种独特的颗粒细胞，能够引起一种独特的静止信号；

2、减少了生长中的窦前卵泡的数量；

3、卵母细胞和颗粒细胞成熟不同步，导致卵泡激活发育异常。

综上所述，MIS通过抑制颗粒细胞的分化和增殖，维持原始卵泡处于静止状态。MIS可能是一种有效的卵巢抑制剂，可用于避孕、衰老或化疗期间卵巢储备的保存。

2

结果展示：

一、原始卵泡颗粒细胞中表达MISR2，外源性MIS抑制原始卵泡激活，确定了MIS在早期卵泡发育中的作用

作者通过确认MISR2在卵泡发育过程中的表达来确定MIS对卵泡发育的作用。RNA原位杂交发现小鼠、大鼠以及人类卵巢的发育过程中，MISR2都是强表达的（图A、B和C）。此外，作者在小鼠卵巢中发现，E19.5到PND2时期的前颗粒细胞和卵巢表面上皮细胞表达MISR2；PND6时期的原始、初级和早期次级卵泡的卵巢表面上皮细胞和颗粒细胞中也表达MISR2（图A）。

为了评估MIS在早期卵泡发育中的作用，作者对PND1小鼠和大鼠卵巢注射携带人类MIS转基因的腺病毒载体，结果发现MIS处理后卵泡体积显著减小（图E和F），MISR2下游典型SMAD信号通路（p-SMAD1/5/8）显著上调，p-AKT显著下调（G和H）。更重要的是，MIS处理后原始卵泡数量虽然有增加趋势，但是初级到各阶段生长卵泡数量均显著减少（图I）。

二、单细胞转录组测序揭示了MIS处理后卵巢多种细胞类型状态发生了深刻改变

为了了解MIS调控卵泡发育的机制，作者对MIS处理6天后的对照组小鼠卵巢和MIS组小鼠卵巢进行了单细胞转录组测序。

利用Seurat过滤低质量细胞后得到9437个细胞，这些细胞在对照组和MIS组中有比较明显的分离（图C），接着使用marker鉴定了11种细胞类型（图B）。作者发现在MIS处理后卵巢主要细胞类型（间质细胞、颗粒细胞、卵巢表面上皮细胞和卵母细胞）出现了明显不一样的亚群（图D和E）。

因此，后续作者就想研究MIS处理后4种细胞类型发生的具体改变。

三、外源MIS在颗粒细胞和卵巢表面上皮细胞（OSE）中诱导共同的转录信号

作者发现MIS组OSE和颗粒细胞共享着被MIS调控的相似基因集（图A和G），RNAish也证实了这一点（图B和H）。MIS组的OSE有61个基因被显著上调（p<0.01），颗粒细胞有559个基因被显著上调（p<0.01），共有的基因有39个基因，其中最显著的包括Igfbp5、Aldh1a1、Kctd14、Id3、Id2和Smad6，其中Id3、Id2和Smad6是已知的MIS典型靶点。

此外，作者还发现MIS组的OSE与MIS调节相关的基因发生了上下调，比如Misr2、Txnip、Lgr5下调，Smad6、Igfp5、Id3、Msx2上调（图A-D），并用RNAish和qPCR证明了上下调关系（图B-D和H-I）。（可以考虑放弃）

有趣的是，MIS组的颗粒细胞和OSE增殖均受到抑制（图E和F）。因此，作者猜测MIS处理后，Id3和Smad6抑制了MISR2的表达，接着MISR2又影响颗粒细胞和OSE的增殖？

四、MIS抑制了颗粒细胞的特异性分化

虽然颗粒细胞和OSE调控了相似的基因表达，但是颗粒细胞仍然有其独特的基因表达模式（图A）。RNAish和qPCR发现MIS处理后的颗粒细胞Krt79基因上调，Tmem184a、Slc18a2、Nr5a2基因下调（图B-D）。

五、外源MIS影响了卵巢间质细胞的基因表达

作者根据P值大小筛选出间质细胞在MIS处理后显著上下调的基因，接着保留下间质细胞的特异性marker或者与其他细胞类型有关联的基因，最后发现Tgfbi、Igfbp3、Cxcl12、Kcnk3基因上调，Stmn1、Ptch1、Ltbp2基因下调（图A-G）。

此外，作者发现MIS处理后，虽然间质细胞的增殖同样受到抑制（图H-K），但是已知上调表达的通路，如Id2、Id3、Smad6却下调表达，作者猜测MIS处理后，不同细胞可能有不同的调节方式。

六、MIS治疗引起卵母细胞状态的轻微变化

研究完卵巢内体细胞的基因表达模式，那么卵母细胞又会有怎么样的表达模式呢？

同样根据P值大小进行筛选，作者发现MIS处理后的卵母细胞只有Hist3h2a、Ubb和Gm9493基因显著差异。

而且MIS组能够表达生殖细胞的marker，其中Figla和Th不仅可以用来鉴定卵母细胞，而且上调表达（图A和B）；而Kit和ZP3基因的相对表达则不受影响（图C-E）。有研究发现，这些上调的基因代表着静止的原始卵泡相对于激活的卵泡所占比例更高，因此作者猜测MIS是否通过上调Figla和Th表达使得原始卵泡无法激活，进而影响卵泡发育。

七、MIS维持颗粒细胞静止，阻止活化卵泡的正常发育。

由于颗粒细胞能够产生MIS，因此作者猜测颗粒细胞与卵泡的发育总有些千丝万缕的关系。

首先作者利用Nr5a1、Fst和Amhr2鉴定出五种颗粒细胞亚群（图A），其中三个亚群是对照组中特异表达的，称为GC-CTL-quiescent、GC-CTL-active和GC-CTL-dividing。两个亚群是MIS组特异表达的，称为GC-MIS-quiescent和GC-MIS-active。作者发现，MIS组缺少active颗粒细胞亚群，而active颗粒细胞亚群具有分裂能力和细胞周期特征，很可能与初级卵泡发育到次级卵泡有关。

（GC-CTL-active和GC-MIS-active表达早期卵泡发育经典的标志物，如Inha、Inhb、Slc18a2和Hsd3b1，而GC-CTL-quiescent和GC-MIS-quiescent则低表达这些相同的标志物（图S7A））。

接着通过计算每个cluster的平均基因表达量构建系统发育树发现，GC-CTL-quiescent与MIS细胞亚群分离（图S7B），猜测MIS抑制诱导了一个类似于静止的转录模式。

因此作者重点研究与静止状态相关的基因包括Btg2、Fxyd6、Egr1、Fos、Zfp36、Junb、Cxcl1、Ier2、Nr4a1、Ppp1r15a、Csrnp2、Jun、Dusp1、Gadd45b、Nfkbia、Cxcl10、Klf4、Id1、Prelp和Ifitm1（图7A），并在PND6-MIS组的小鼠和大鼠卵巢中进行验证（图B、C），表明MIS组中高表达静止状态相关的基因。

接下来作者为了证明MIS抑制诱导了一个类似于静止的转录模式的猜测，分别在对照组和MIS组的体外条件下培养单个原始卵泡，结果发现卵泡激活率显著降低（图7D），进一步证实MIS组直接维持了原始卵泡处于静止状态。

DDX4 (Vasa)作为生殖细胞标记，INHA作为活化颗粒细胞的标记。

为了进一步验证此猜测，作者对正在生长的卵母细胞卵泡进行了表型分析。

与对照组相比，MIS组中没有活化的原始卵泡（图G），MIS组卵巢中卵母细胞很大，不仅达到初级卵泡中卵母细胞的大小，甚至达到了次级卵泡的卵母细胞大小，且含有鳞状颗粒细胞，表明颗粒细胞发育迟缓（图E、F）。大鼠卵巢的HE染色再次证实了这一观点，MIS组颗粒细胞层更少，呈鳞状，表明颗粒细胞增殖缺陷（图H），同时也表明颗粒细胞增殖的缺陷和卵泡发育的抑制独立于卵母细胞的生长。

Misr2作为原始卵泡标记物和Nr5a2作为颗粒细胞激活标记物。

为了证实MIS抑制卵泡发育不是由抑制卵母细胞生长驱动的，而是由颗粒细胞成熟的不同步驱动的，作者发现对照组和MIS组的小鼠卵母细胞大小没有显著差异，但是MIS组卵母细胞的生长速度降低了（图I和J）。表明MIS通过抑制颗粒细胞的分化和增殖，降低卵母细胞的生长速度，维持原始卵泡处于静止状态，进而抑制早期卵泡发育。

综上所述，MIS通过抑制颗粒细胞的分化和增殖，降低卵母细胞的生长速度，维持原始卵泡处于静止状态，同时减少生长中窦前卵泡的数量，进而抑制早期卵泡发育。

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