Nature Genetics: 宏基因组+Olink蛋白组结合=多组学研究

多组学分析解释疾病机制系列之1

编者按
多组学的应用，在近几年越来越被重视；Olink公司的蛋白质组检测以高灵敏度，高重复性，高特异性的特色，为研究者提供了非常优异的数据质量，从而使得多组学真正能够“落地”，越来越受到研究者的关注。2018年底，就有研究者使用Olink CVDII功能蛋白panel，发表了基于肠道宏基因组和遗传因素的蛋白质组研究，肠道微生物组在心血管疾病中的作用有一些研究，但是其具体机制尚不清楚。在这篇Nature Genetics文章中，作者提出了一项宏基因组（metagenome-wide association study）和全基因组（systems-genome-wide）关于92种心血管疾病相关蛋白血浆浓度的全系统相关研究。鉴定出了73种功能蛋白质的相关遗传变异（pQTL）和41种功能蛋白质的微生物关联，其中31种蛋白与两者均相关。所鉴定的遗传和微生物因素主要发挥附加作用，并共同解释了高达76.6%的个体间变异（平均17.5%）。有意思的是，遗传学对免疫相关蛋白的浓度个体差异贡献最大，而肠道微生物组对参与代谢和肠道健康的蛋白质个体差异贡献最大。研究者发现了几种宿主-微生物的相互作用，它们影响了参与上皮功能、脂质代谢和中枢神经系统功能的蛋白质。本研究为心血管疾病中的联合遗传和微生物效应提供了重要证据，并为未来在个性化医学中的应用提供了方向。而Olink公司最新推出了基于NGS技术的Olink Explore 3072蛋白质组试剂盒，该试剂盒的蛋白清单覆盖了所有的Pathway相关蛋白质，相信，在今后的研究中，可以为类似的研究者提供更加有力的研究工具。核心摘要
新一代高通量测序技术的进步已经彻底改变了我们对人类基因组和肠道微生物组对人类健康的影响和理解。全基因组关联研究和宏基因组关联研究提供了证据证明了许多复杂疾病可以由人类基因组和微生物组及其相互作用来决定。例如心血管疾病，2型糖尿病，炎症性肠病（IBD），和不同类型的癌症。然而，肠道微生物组和基因组相互作用对大分子性状的影响，很大程度上是不清楚的，这极大限制了我们对复杂疾病与微生物组关联的机制解析。生物大分子中，循环血浆蛋白通常被用作各种疾病的危险因素或生物标志物。深入了解遗传学，肠道微生物组及其相互作用对循环血浆蛋白个体间差异的影响，将为健康和疾病中的宿主-微生物的相互作用提供更深入的见解。本文中，作者对来自荷兰的LifeLines Dutch的两个队列，LifeLines-Deep1（n=1178），和LifeLines-Deep2（n=86）进行分析，队列中采集了基因分型，肠道宏基因组，转录组和详细的临床表型信息，蛋白质组检测选择了Oink公司的Olink Proseek Multiplex CVD III panel（http://www.olink.com/products/cvd-iii-panel/），这个panel里包含92个在心血管疾病发展中直接或者间接作用的功能蛋白，并且发现在其他疾病中也有着非常广泛的联系，因此，我们相信，在此次分析中获得的数据，可以推广到更广泛的疾病类型里，从而影响我们发现更多的疾病病理生理的机制。（研究设计和相关蛋白质情况见下图）拓展阅读

 感兴趣的读者可以接下来继续来看结果分析：

1.    分析评估宿主遗传学对蛋白质水平的影响：
这个部分涉及到了pQTL的分析，pQTL分析中，通常因为在遗传信息中引入了更接近疾病表型的蛋白质信息，通过孟德尔随机化（Mendelian randomization）分析，更容易得到蛋白质和疾病关联的因果关系，从而发现新的药物靶点和诊断标记物（如下图）。

1）局部蛋白定量性状位点（local protein quantitative trait loci ，cis-pQTL）分析：

搜寻编码92蛋白基因250kb内的SNPs。（Manhattan plot of 129 cis-pQTLs for 66 proteins.）

2）全基因组跨QTL映射分析（genome-wide trans-pQTL mapping）：

如下图：相关的反式片段和蛋白的染色体位置被突出显示。snps被标记为红色条，映射的蛋白质被标记。每个弯曲的箭头都表示从snp到蛋白质的反式pQTL效应。

3）本次分析数据中排除了已被发现的关联后，还揭示了新的pQTL关联，包括25个蛋白的36个cis-pQTLs和27个蛋白的48个反式pQTLs。

并且和转录组数据比较显示了基于转录组的eQTL分析并不能很好的反应现象，例如，相比之下，85个反pQTLs在表达水平上都没有被检测到。

2.    Olink CVD panel相关蛋白与肠道微生物组的关联分析：
研究者评估了Olink CVD panel中相关血浆蛋白质浓度和微生物组的各种数据集之间的关联，包括香农指数（Shannon index，菌群多样性指数）评估的菌落多样性分析、布雷-柯蒂斯距离评估（Bray-Curtis distance，是生态学中用来衡量不同样地物种组成差异的测度。）的多样性、355个细菌类群（包括164个细菌种和191个上层类群）和438个细菌MetaCyc通路数据（阐释代谢通路的数据库，包括相关的化合物，酶和基因）。结果发现，在FDR0.05水平上，共有41种独特的蛋白与至少一种微生物特性相关。结果如图示：虽然大多数微生物与蛋白质的联系是新颖的，但一些蛋白质以前就被发现与肠道微生物组有关，包括纤溶酶原激活酶抑制剂(PAI)-1和尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、表皮生长因子受体(EGFR)、对氧磷酶家族(PON)、肿瘤坏死因子受体（TNF-R2）以及胰岛素样生长因子(IGF)例如，胃病原体幽门螺杆菌刺激胃上皮细胞中PAI和uPA及其受体(uPAR)的表达，也可以通过激活EGFR部分影响上皮信号通路。对宿主基因组，蛋白组以及微生物组进行联合分析，发现有31种蛋白同时和基因组合肠道宏基因组信息关联（如下图）3.    由遗传学和微生物组解释的蛋白质差异；
然后，研究者通过遗传和微生物因素分别量化个体蛋白质差异解释的比例。顺pQTL效应解释了66个顺式调节蛋白平均变异的14.9%（范围0.35–73.3%）。反pQTL效应解释了36个反调控蛋白的平均9.5%的变化（范围0.7–51.8%）。与宿主遗传因素相比，微生物特征的影响较小，41种蛋白平均占变异的3.2%（范围0.4–26.5%）。

Proportion of inter-individual variation explained by genetic and microbial factors. Each bar represents a protein. Y axis is the explained variation. Proportion of variation is separated into cis-pQTLs (blue), trans-pQTLs (green), and microbiome (red).

4.    脑肠轴（gut-brain axis）的多组学启示：
中枢神经系统(CNS)正成为控制体重指数和肥胖及相关发病率的重要因素。除了在肠道和代谢中起作用的蛋白质外，研究者还发现一些与肠道微生物组相关的蛋白质在神经系统中很活跃。其中，最值得注意的是接触蛋白1(CNTN1)和Notch3，它们都参与了在神经系统发育中发挥重要作用的NOTCH信号通路，以及EGFR通路，一种表皮生长因子通路。下图突出介绍了两个子网络：一组参与新陈代谢的蛋白质（浅绿色区域)和一组参与神经系统(浅红色区域）的基因。文章中还分析了很多相关多组学分析后蛋白质在心血管，糖尿病，肥胖（BMI）等等复杂疾病中的作用，可以具体参考原文和相关报道。总之，这些结果证明了复杂的基因-微生物组在调控循环蛋白中的相互作用，调节各种生物过程，并证明这些效应可以在许多不同的器官和组织中看到。这项研究提供了概念上的进展，为未来在个性化医学中的应用奠定了重要的基础，这将不得不同时考虑到蛋白质组，基因组和宏基因组的综合分析。

参考文献：

1.Zhernakova, D.V., Le, T.H., Kurilshikov, A. et al. Individual variations in cardiovascular-disease-related protein levels are driven by genetics and gut microbiome. Nat Genet 50, 1524–1532 (2018). https://doi.org/10.1038/s41588-018-0224-7

2.Zheng, J., Haberland, V., Baird, D. et al. Phenome-wide Mendelian randomization mapping the influence of the plasma proteome on complex diseases. Nat Genet 52, 1122–1131 (2020). https://doi.org/10.1038/s41588-020-0682-6

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