小白必看！带你走进空间转录组 | 单细胞专题

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生命科学研究的目的之一就是为了解决细胞和组织以及该组织如何影响功能这一难题。测序技术可提供特定条件下某些 组织中基因的表达信息，不仅可以推断出相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制，而且可以辨别细胞的类型和异质性，为疾病诊断提供理论依据。但由于研究的深入或具体研究方向和内容的不同，传统的转录组测序技术显然不能够满足科研工作者们强烈的好奇心，更加全面且直观地反映组织中基因的表达情况，随即单细胞转录组测序（Single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）、空间转录组（Spatial transcriptomics，ST）测序等一系列技术应运而生。

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为什么空间转录组成为了研究热点？

Nature杂志及其子刊每年都会总结一年中的研究成果，根据每个领域的重大发现，推选出最有价值的技术为年度技术。2018年的“单细胞转录组技术”、2019年的“单细胞多组学技术”以及2020年年度技术方法“空间转录组技术”无疑不证明了带有单细胞和空间分辨率转录组技术应用的重要性。

以Spatial transcriptomics为关键词在PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）上检索标题带有该关键词的文章，发现2016年一篇发表在Science上名为“Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics”的文章打开了空间转录组的大门。而2016年至今仅检索到60+篇文章运用到了这一技术且30+篇的影响因子平均水平竟均在10分以上！

转录组技术的发展主要经历了三个重要的阶段：第一个阶段是对大量混合细胞进行转录组测序，该方法获得的是大量细胞的基因平均表达水平，虽然推进了对细胞群体的特性认识，但无法获知群体内特定细胞的基因表达情况；第二个阶段是单细胞转录组测序，该技术对细胞基因表达的认识推进到单细胞的层面，目前已在新细胞类型的发现，揭示细胞异质性等方面展现出优势。但由于单细胞悬液的获得需要对组织进行酶解，悬液中的单细胞失去了组织空间位置信息，导致有些单细胞在酶解过程中或离开特定微环境后，基因表达谱会发生变化，且某些特殊形态的细胞，如大脑中结构复杂的神经元和神经胶质细胞，难以通过组织酶解获取；而空间转录组测序可以同时获得细胞的空间位置信息和基因表达数据，且不需要制备细胞悬液，进一步推进了对组织原位细胞真实基因表达的研究，为组织细胞功能、微环境互作、发育过程谱系追踪、疾病病理学等多个领域提供了重要的研究手段。

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什么是空间转录组测序？能解决什么问题？

由于细胞作为机体的基本单元，在特定的空间位置与微环境协同，发挥其特有的生物学功能，所以对于研究和理解细胞生物学、肿瘤生物学、发育生物学等学科的发生机制来说，空间位置信息尤为重要。显微成像（包括超分辨率和单分子成像）、多重荧光原位杂交等技术的发展加深了我们对细胞、组织结构和功能的理解；测序技术使得我们能够对未知的细胞或组织中基因的表达情况进行定量和定性分析。空间转录组可以结合显微成像和测序技术在获得基因表达数据的同时最大程度的保留样本的空间位置信息，使得研究人员能够发现更多有价值的东西。

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空间转录组测序有哪些研究方法？

1、Spatial Transcriptomics（ST）^[1]

利用基因芯片技术将样本位置信息保留在芯片上，再利用二代测序技术对样本中的RNA进行测序，读取的内容叠加回组织图像上，从而生成了组织切片上完整的基因表达图像，这一技术在临床研究和癌症诊断中具有极高的价值。此后，在ST的基础上，研究人员陆续探索出多个原位捕获空间转录组学技术如High‐Definition Spatial Transcriptomics（HDST）、Slide-seq等。

优势

可获得空间维度的转录本分布信息

局限性

无法做到单个细胞的分辨率

2、Apex-Seq^[2]
抗坏血酸过氧化物酶（APEX）是一个可以在活细胞中基于邻近反应对蛋白质和核酸进行标记的工具酶，可催化生物素苯酚的氧化而产生生物素苯酚自由基，苯酚自由基可以修饰在邻近蛋白的侧链上从而实现蛋白的生物素标记，对纯化标记后的RNA使用链霉亲和素珠进行分离并进行RNA测序，可以从活细胞评估单个细胞结构域内的整个转录组概况。

优势

可在空间水平上表明不同细胞器蛋白质组学以及蛋白质与蛋白质互作网络

局限性：

a. 需要重组技术，所以不适用于正常组织

b. 可广泛用于哺乳动物细胞中，但对于微生物，生物素-苯酚（BP）底物的标记效率较低

3、GeoMx Digital Spatial Profiler（DSP）^[3]

一种专门针对肿瘤免疫和肿瘤微环境设计的空间多靶标技术，2019年AACR一经推出就受到全球肿瘤学家和肿瘤免疫学家的热捧。该技术可基于肿瘤微环境的各种免疫相关蛋白标记物的数量和空间分布的变化，通过对肿瘤富集区、基质区域、免疫细胞富集等区域进行分群，选择性分析感兴趣区域（Region Of Interest, ROI），在抗体或者RNA上偶联DNA Oligo，每个DNA Oligo对应一个靶标，当抗体或RNA与组织上的靶标结合后，DSP利用激光切断DNA oligo与抗体或RNA之间的连接物，从而释放出DNA Oligo以进行下一步定量。

优势

a. 激光激活的精度范围最小为10微米，可达到单细胞水平

b. 可在载玻片上根据组织轮廓选取ROI，甚至选取稀有细胞群体进行分析

局限性

灵活性较低的专用平台，抗体和探针的设计只针对肿瘤免疫和神经科学的应用

4、Multimodal intersection analysis（MIA）^[4]

为了注释不同组织区域的精确的细胞组成，MIA基于10x Genomics Visium平台整合单细胞转录组（scRNA-seq）数据和ST数据，通过计算某区域的差异基因与scRNA-seq数据鉴定的细胞类型差异基因之间的重叠程度，来推断特定组织区域中特定细胞类型的富集情况。

优势

a. 在获得空间维度转录本分布信息的同时实现“真”单细胞水平检测

b. 样本兼容性强，无需提前选择感兴趣的区域，无偏性捕获所有mRNA

c. 易与其他病理分析的方法和工具整合，也易和NGS流程整合

d. 平台具有较强的扩展性，容易被接受整合进现有的实验室

局限性

实验过程中需要人工操作

5、Deterministic Barcoding in Tissue for spatial omics sequencing（DBiT-seq) ^[5]

使用微流体通道直接传送条形码探针并能同时捕获转录本和选定的蛋白质靶标。

优势

a. 不需要复杂的成像技术，而是利用高通量测序NGS和DNA条形码技术获得转录组和蛋白组学的信息的同时获得空间信息，可实现更高的样品通量和成本效益

b. 适用样本广泛，包括新鲜组织、冰冻组织、FFPE样本

局限性

条形码探针为基础的技术在分辨率、每个bin的基因/转录物平均数目、以及多个bin之间的捕获率之间未达到平衡

[1] Patrik L. Ståhl,Fredrik Salmén. et. al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science,2016.

[2] Furqan M. et. al. Atlas of Subcellular RNA Localization Revealed by APEX-Seq. Cell,2019.

[3] Cabrita Rita. et. al. Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma. Nature,2020.

[4] Andrew L. et. al. Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma. Cell,2020.

[5] Liu Yang. et. al. High-Spatial-Resolution Multi-Omics Sequencing via Deterministic Barcoding in Tissue. Cell,2020.

OUEAM和联川小姐姐一起从零开始学空转

大家可能还不知道吧，本文的作者小姐姐是一名刚刚加入联川两个月新手小白哦，对于转录组测序还是有很多问题想要和大家一起交流的，所以如果您对空间转录组测序有任何疑问和问题都可以在文末留言，小姐姐将会把问题进行收集整理并逐一回复哦，还在等什么？快来和小姐姐一起交流进步吧！

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