即将突破FFPE限制，空间转录组未来之路已开启？ | 单细胞专题

提起空间转录组，不得不提起就是当今商业化最为成功的单细胞测序平台供应商之一——10X Genomics（以下简称10X公司）。10X公司旗下的空间转录组商业化平台Visium一经推出，就在全球掀起了一股热潮。

但是目前10X公司并不是全球唯一的空间转录组技术供应商，无论是学术界还是工业界，一些“后浪”们也正蓄势汹汹地赶来挑战Visium的王者地位。

显然，现如今还只能做冰冻组织切片的10X Visium技术已无法满足临床和基础医学研究。大量的FFPE样本是研究人员值得挖掘的宝藏，一旦突破技术瓶颈，空间转录组极有可能迎来一大波学术研究的爆发。

据悉，面对“后浪”们的压力，10X公司宣布拟定在2021年第二季度发布升级后的空间转录组技术，以满足FFPE样本的研究。

那么开始今天的话题之前，我们先来简单科普一下，空间转录组能够干什么？

什么是空间转录组？

空间转录组（Spatial Single Cell Transcriptome）是一种能够将RNA表达情况直接在组织层面进行解析的新型单细胞测序技术。这种技术能够将一定范围内组织切片上所有RNA表达信息一网打尽。相比于Bulk RNA-seq（也就是我们所说的常规转录组）以及单细胞转录组，空间转录组彻底将分辨率提升到了空间水平。

由于单细胞测序在组织解离的过程中，将组织消化成单细胞悬液，这个过程单个细胞中RNA表达在空间上的信息已经丢失。在后期，科研人员仍需重新在研究的组织上利用RNA FISH探针或免疫组化的方式进行验证。

空间转录组技术能够利用将带有oligodT磁珠的反转录引物直接附着在组织切片表面，继而使得后期获取RNA在组织某个部位表达成为可能。

在诸如传统的单细胞转录组测序（如10X Genomics的Chromium平台和BD的Rhapsody平台）已经无法满足研究人员对大规模RNA在组织部位表达进行解析的需求下，空间转录组应运而生。通过空间转录组技术可获取组织中具体位置的转录信息，为研究和诊断提供有效数据支撑。

空间转录组原理是什么？

当冰冻组织切片附在空间转录组所使用的载片上时，带有空间位置的barcode标签引物会从对应空间组织中把mRNA进行反转录组，之后得到的cDNA中就直接带有了空间位置信息的barcode。后续测序下机数据中，分析带有空间位置barcode的mRNA能够反推到组织的位置中，最终拼贴形成组织样品的空间转录组图像。

这种技术将原有的FISH或免疫组化只能做一种或几种分子的检测通量一下子提升了上千倍。它的优点也显而易见，每个RNA分子都有空间的barcode信息使得组织特异性研究在视觉呈现上非常明显，此外检测通量的大大提升使得研究人员无需对RNA分子再进行单独的重复检测。     

空间转录组大混战，

FFPE样本能否成为新的技术制高点？

如果你认为市面上只有10X公司才有空间转录组技术那你就大错特错了。事实上在这个热点上，各国的科学家和工程师都争相角逐这个技术高峰，发表了诸多高质量的研究论文。

目前主流的空间转录组技术（涵盖中低通量和高通量）超过了十种以上。我们熟悉的有FISSEQ（哈佛大学George Church课题组）、SeqFISH（加州理工蔡龙课题组） Slide-seq（麻省理工Chen F课题组）、GEO-seq（中科院上海生化与细胞所景乃禾课题组）、DBiT-seq（耶鲁大学樊荣课题组）、LCM-seq（卡罗林斯卡学院Deng Q课题组）、Spatial Transcriptomics（卡罗琳斯卡研究所Jonas Frisén课题组）、MERFISH（哈佛大学庄小威课题组）等。

目前所发表的论文来看，高通量空间转录组技术大致可以分为激光显微切割技术和空间条形码技术两大流派。

以景乃禾课题组所使用的GEO-seq为例，就是一种非常典型的基于显微切割和单细胞微量扩增方法，将目标区域进行切割后将对应的细胞进行测序。

而10X Visium则是非常典型的基于芯片和空间条形码技术发明的高通量的空间转录组测序方法。

事实上10X Visium技术最早脱胎于瑞典卡罗琳斯卡研究所等单位发表在Science上的一篇名为Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics的文章。

随后，这些研究人员立马成立了一家名为Spatial Transcriptomics的公司（以下简称SP公司），如果对这个名字进行直译简直是非常粗暴非常直接——空间转录组！2018年10X公司对其进行收购后，其官网上Logo下方已打上了Part of 10X Genomics字样，正式加入10X家庭大礼包。10X公司随即在2019年推出商业化空间转录组平台——Visium。

但是这项技术与目前现存诸多项空间转录组技术一样，适用范围只能是冰冻组织切片，但无法对FFPE样本进行检测。

事实上拥有瑞典血统的空间转录组技术公司可不止只有SP公司，Cartana同样也虎视眈眈。因为这家公司宣称能够对FFPE样本进行检测。为了消除潜在的竞争关系，依旧是熟悉的味道，10X公司重金收购了Cartana。

无奈的是，宣称能够检测FFPE样本的公司可不止Cartana一家。还记得前面提到的遗传学大牛George Church的FISSEQ原位杂交测序法吗？这项技术脱胎于2014年发表在Science上一篇名为Highly Multiplexed Subcellular RNA Sequencing in Situ的文章。

紧接着基于FISSEQ技术成立的初创公司ReadCoor宣称，该公司发布的RC2平台不仅在精度上超越Visium而且也能支持FFPE样本，并将空间转录组分辨率提升到了真正的单细胞水平。

又是熟悉的味道，10X公司发挥了买买买的风格，花费3.5亿美元收购ReadCoor公司。ReadCoor也终于在2020年正式加入10X豪华大礼包。

就在10X公司觉得高枕无忧之际，来自耶鲁大学的樊荣教授于2020年11月在Cell上投下一颗重磅炸弹——DBiT-seq。这就意味着10X公司短时间内，无法彻底清扫市面上的竞争对手。

预计从2021年开始，空间转录组热点已经开始转向能不能在FFPE样本上开展。可见在未来的几年内，FFPE空间转录组技术将迎来大爆发。

代表性FFPE空间转录组技术简介

前面提到的几种能够对FFPE进行检测的空间转录组技术，由于篇幅所致，在本章节中笔者仅以Cartana的Padlock技术和樊荣教授的DBiT-seq技术为例，稍微为大家做一个简介。

a. 瑞典Cartana的Padlock锁式探针技术

原位分析（in situ analysis）是一种全新的基于荧光杂交探针解析靶RNA的空间转录组技术，可以直接在组织切片上进行原位分析。其缺点只能基于研究人员感兴趣的靶基因进行探针设计，而无法同时对切片上大量RNA进行平行检测。

Cartana公司新开发的原位技术允许研究人员分析的样本类型包括新鲜样本、冷冻组织样本或FFPE样本，并快速创建多达数百个基因的单细胞基因表达图谱。

其核心技术为锁式探针（Padlock），可实现多达数百种不同RNA序列的高特异性原位高通量测序文库制备。

高特异性的探针将与研究人员感兴趣的基因进行RNA杂交。在探针的3’和5’端有区域与目标RNA锚定后，RNA ligation成环后，DNA聚合酶进行局部滚环复制扩增（RCA）用于后期的信号放大。最终产生了能够检测到的RNA转录本靶点（spot），该spot包括了多个原位杂交barcode的拷贝序列，并与检测到的RNA靶基因原始位点（original position）相一致。

这项技术关键在于锁式探针上含有原位杂交的barcode，由于后期Adapter Probe的锚定。不同的Adapter Probe会发出不同的荧光信号。

随后就是从测序数据中，去解码/解析（decode）那些带有不同靶基因spot的barcode。这些barcode蕴含着靶基因不同的空间位置信息。

第一个接头序列探针库（adapter probe pool）与spot的杂交，并且与荧光标记的测序探针库进行匹配，当荧光信号搜集结束后，会将信号从spot上移除，随机进入下一轮荧光信号搜集，以此往复。

由于每个spot都有独一无二的荧光信号，多轮扫描结束后，每种RNA的荧光信号空间位置就会非常明确。

据悉，这项已经被10X收购的专利，将于George Church创办的另一家公司ReadCoor的RC2平台一起，作为10X空间转录组技术储备中的重要环节，成为2021年10X公司推出基于FFPE空间转录组产品的重要底层技术之一。

b. DBiT-seq

来自耶鲁大学的繁荣教授课题组，于2020年11月在Cell上发表的High-Spatial-Resolution Multi-Omics Sequencing via Deterministic Barcoding in Tissue，简称DBiT-seq。这项技术是在底层原理上与Cartana及ReadCoor完全不同的空间多组学技术（包含转录组和蛋白组）。

其实早在2020年的10月，樊荣教授就已经率先在预印本BioRvix中称，FFPE样本作为获取最为丰富的临床样本之一，目前单细胞测序技术无法满足相应的需求，一旦可以在FFPE样本中实现空间转录组测序，将是一项巨大的突破。

DBiT-seq将含有平行微通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片置于组织载玻片上，微流控通道用于将分子条形码以空间受限的方式传递到甲醛固定的组织玻片表面。第一种微流控芯片通道在组织切片表面，加入oligodT的DNA条形码A1-A50，可结合组织上的的mRNA并在原位上反转录成cDNA。随后垂直放入第二种微流控芯片通道，引入第二组特定细胞表面蛋白的DNA条形码B1-B50。A1-A50和B1-B50交叉原位连接，产生组织像素的二维拼接，每一个拼接点都包含完整条形码AiBj的唯一组合(i=1-50, j=1-50)。这种方法便捷之处在于同时检测固定的组织切片上的mRNA和蛋白质，后期还可以延伸到其他组学。

例如特定的DNA修饰、RNA修饰及组蛋白修饰，可以利用融合蛋白改造，将这些改造后的蛋白与DNA条形码结合。后续通过测序来解析高分辨率的空间多组学图谱。

DBiT-seq从底层原理上完全不同于Cartana公司的技术，樊荣教授将微流控技术彻底发扬光大。如何在狭小的空间范围内限制特定的探针既要完成杂交又要完成反转录，是一项艰巨的考验。中间的任何一个环节，都会让信号在放大过程中产生错误。

据悉这项技术每个Pixel最小的分辨率接近10μm，近乎于接近单细胞水平。DBiT-seq适用样本包括新鲜组织、冰冻组织、FFPE样本等。

未来应用场景下沉猜想

当下，无论是国内还是国外，空间转录组仍然是少数课题组用于尝鲜的新技术，离大规模应用还有很长的一段距离。即便是诸多课题组和公司纷纷布局空间转录组，面对着雷声大雨点小的争议，更多的科研人员仍然处于观望状态。

Visium的操作较为复杂，一旦失败，对于经费不足的课题组也是巨大的成本浪费。空间转录组在操作上如何更加的自动化便携化傻瓜化，是未来许多初创公司共同的目标。

已经将ReadCoor、Cartana等悉数收入囊中的10X公司，宣布将在2021年第二季度正式推出基于FFPE样本的空间转录组技术。而ReadCoor创始人George Church和Cartana创始人Mats Nilsson已成为10X公司的科学顾问。

即便是FFPE样本能开展空间转录组，目前基于冰冻组织切片开展研究的Visium平台仍然有不可替代的作用。前者可以根据感兴趣的靶基因信息，对探针进行定制化，但是检测基因数量仍然有限。而后者则能拿到组织上完整的RNA信息，通过oligodT反转录所有mRNA，这是前者无法拥有的优势。

所以应用场景与现在捕获测序非常相似，存在大panel、小panel、全外显子及全基因组测序并存的局面。基于感兴趣基因而开发靶基因探针panel对应检测FFPE样本，继而可能会成为临床大队列样本研究的一种新的尝试。而新鲜样本或冻存样本可以对RNA进行全局扫描，可以开展更深入的分子机制研究。冻存组织研究分子机制+FFPE样本大规模验证很有可能成为今后几年科学研究的方向之一。所以两种不同的研究样本类型，会来今后很长的时间里面并行。

至于在药企和医院的检验科，能否替代传统的PCR或免疫组化等检测方法，目前来看仍然为时尚早。但是可以期待的是，一旦FFPE样本能够被盘活，将是临床及基础医学研究的一个重大突破。

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