Gut文章教你讨论中药、肠道菌群与抗肥胖的因果关系 | 微生物专题

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）以及它的无性菌丝体（Hirsutella sinensis）在中医调理中具有悠久的应用历史，科学家已经从药理学的角度证明了它们的多种生物活性成分确实具有降血糖、降血脂、抗氧化及调节免疫功能等多种功效；而具体影响机制则有很多，本文揭示了一种新的作用机制：冬虫夏草菌丝体中提取了一种新的益生元——大分子多糖H1可以调节肠道菌群，对饮食导致的肥胖及II型糖尿病的预防效果。

发表期刊：Gut

发表时间：2018

影响因子：17.943

研究内容：冬虫夏草菌丝体的多糖产物是如何通过肠道菌群发挥抗肥胖作用

实验方法：16S rRNA基因测序

材料与方法

每个笼子中圈养4到5只四周龄C57BL/6J小鼠，进行12小时暗光循环、自由获得食物和无菌饮用水条件下适应1周。继续用标准饮食喂养正常小鼠12周，并添加同体积生理盐水作为标准对照，而小鼠进行高脂饮食喂养12周命名为HFD（高脂）小鼠，并分别用同体积生理盐水、冬虫夏草菌丝体（H. sinensis mycelium，HSM）水提物、依据多糖分子量大小而分成H1（>300kDa）、H2（10-300kDa）、H3(<10 kDa)、H4(低聚糖和碳水化合物)组分对HFD小鼠进行饮食干预处理。研究发现

1. HSM及其多糖组分对小鼠体重的影响
通过检测小鼠的体重、内脏脂肪重量、肝脏重量、血清甘油三酯和HOMA-1R（胰岛素抵抗指数）指标等，结果显示给予H1级分含有分子量大于300 kDa的多糖可在12周后将体重降低约50％（图1B–D）。H1还降低了HFD小鼠的内脏脂肪和HOMA-IR指数，产生的效果与HSM水提取物观察到的效果相似（图1E、F）。H4级分包含低分子量的寡糖和碳水化合物不会影响体重或肥胖特征，但H2和H3减少了内脏脂肪重量，但对体重和HOMA-1R指标没有影响（图1B–F）。2. HSM及其多糖组分对小鼠代谢的影响
HSM和H1不会影响能量摄入或脂质吸收，表明这些治疗方法不会调节食欲或脂质吸收。同时不会影响盲肠或结肠中短链脂肪酸（SCFA）的生成，但HSM和H1降低了血清甘油三酸酯（参见补充图S4A）和参与脂肪和肝组织脂解，脂质转运和摄取以及脂肪形成的基因表达。H2-H4级分影响部分而非全部脂质代谢参数。与HFD相比，HSM和H1-H3治疗降低了空腹血糖，而只有HSM和H1降低了空腹胰岛素。HSM和H1同时降低了促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的血清水平。3. HSM和H1干预可预防肠漏和代谢性内毒素血症先前的研究表明，HFD会降低肠紧密连接蛋白（例如，小带闭合蛋白1（ZO-1））的表达并破坏肠屏障完整性，从而导致细菌LPS易位到血液中（即代谢性内毒素血症）并产生炎症和胰岛素抵抗。HSM和H1可以显著降低HFD喂养小鼠的血清内毒素水平（图2A）和肠通透性（图2B）。这些观察结果伴随着用HSM或H1处理的小鼠结肠中ZO-1的表达增加（图2C）和促炎性细胞因子的mRNA表达减少（图2D，E）。相反，H2-H4级分不能逆转血清内毒素血症（图2A），肠通透性（图2B）或结肠促炎性细胞因子或ZO-1的表达（图2C-E）。HSM和H1显著增加了喂食HFD的小鼠结肠固有层中抗炎细胞因子IL-10的调节性T细胞水平（图2F），同时降低了表达促炎性IL-1β的M1巨噬细胞的水平（图2G）。此外，H1减少了LPS诱导的细胞单层破坏（图2H，使用TEER分析测量），并增加了结肠Caco-2细胞中ZO-1 mRNA表达（图2I）。4. HSM和H1的抗肥胖作用可通过粪便移植转移肠道菌群有助于饮食诱发的肥胖症和相关代谢紊乱的发展, 考虑到HSM和H1降低了血清内毒素血症和肠道通透性, 那么HSM和H1的有益作用是否由肠道菌群介导？将采用生理盐水、HSM、H1和H4组分干预的HFD小鼠及生理盐水干预的正常食物喂养的小鼠肠道微生物移植至HFD受试小鼠中。结果显示：与对照组相比，HSM、H1组分干预HFD小鼠及正常食物喂养小鼠的粪菌移植能够减轻HFD受试小鼠的体重和改善肥胖体征，增加结肠ZO-1 mRNA的表达，降低CLS损伤及肝脏中有NAFLD和NASH的迹象；而生理盐水和H4干预的肠道微生物未能逆转HFD受试小鼠的肥胖体征。以上结果表明HSM和H1干预的抗肥胖作用是由肠道微生物介导的。5. 新霉素消除了H1的抗肥胖作用为了确定H1的抗肥胖作用是否取决于特定肠道细菌的存在，用抗生素混合物对H1喂养的HFD小鼠进行了治疗，其中包括克林霉素（C），甲硝唑（M），青霉素（P），万古霉素（V）和新霉素（N）（图3A）。对照组采用不含抗生素的无菌饮用水（DW）处理。结果显示:无抗生素的DW对照组，其中H1减轻了体重增加和肥胖特征,而采用CMPVN抗生素混合物处理可抑制H1干预的抗肥胖作用（图3B-H）。为了确定单一抗生素是否可能引起这些效应，用单独的抗生素治疗了小鼠，值得注意的是，除了血清IL-1β（图3E）外，新霉素始终消除H1的抗肥胖作用，其他单一抗生素处理均未能阻止H1的作用。6. 鉴定H1富集的新霉素敏感肠道菌群
通过16S rRNA基因测序来分析H1在肠道菌群中产生的变化，对不同处理（生理盐水、H1、H1和CMPV、H1和N（新霉素）、H1和CMPVN处理HFD小鼠12周，阴性对照组为生理盐水处理的正常小鼠）的小鼠盲肠样本进行16S rRNA基因测序，结果显示：H1干预或抗生素处理过的HFD小鼠盲肠中的40种细菌发生了显著变化（图4B、C），与HFD相比，H1改变了16种细菌（图4B、C）；H1与HFD相比，图4C中以红色突出显示了11种增加的物种，以绿色突出显示了5种减少的物种。在经H1处理的HFD组中，补充CMPV，N或CMPVN分别改变了19、25或27种细菌。与HFD相比，正常饮食仅影响9种细菌的水平，表明H1以特定方式调节肠道菌群。值得注意的是，H1显著改变了四个物种的含量，包括P. goldsteinii, I. butyriciproducens, C. cocleatum和S. algae，但N和CMPVN却将其逆转。为了检查肥胖相关性状是否与H1富集的新霉素敏感肠细菌水平相关，Spearman的相关分析表明，这些细菌的水平与肥胖性状呈负相关，在这些细菌中，金黄色葡萄球菌通过H1处理高度富集（图4B，C），并且该物种与所有肥胖特征负相关（图4D），其他H1调节的新霉素敏感细菌的水平也与金黄色葡萄球菌的水平相关，这些结果表明，P. goldsteinii和新霉素敏感的肠道菌群可能介导H1的抗肥胖作用。7. 体外新霉素处理消除H1干预的抗肥胖作用
为了消除抗生素对宿主产生的潜在副作用，在FMT之前用离体抗生素对粪便菌群进行了离体治疗，每天收集H1干预的HFD喂养小鼠的粪便微生物样本，用抗生素或生理盐水培养，口服喂给HFD喂养的受试小鼠（图5A），如预期的结果：H1处理的小鼠的HFD诱导的肥胖症特征显著降低，来自CMPV治疗的H1粪便微生物群FMT预防了HFD动物的肥胖性状。（图5B–H）8. 体外粪菌移植中P. goldsteinii与肥胖特性呈现负相关通过分析了前FMT小鼠的微生物群，以确定在供体和受体小鼠中被H1富集但被新霉素或CMPVN减少的细菌。在供体组中，与HFD相比，H1显著改变了8种细菌的水平，但新霉素和CMPVN却逆转了8种细菌的水平（图6A，B）。金黄色葡萄球菌在H1供体小鼠中显著富集，但在新霉素或CMPVN的作用下显著减少。基于定量PCR，我们观察到H1处理后金黄色葡萄球菌的绝对计数增加，但供体和受体小鼠中的新霉素或CMPVN均大大减少了细菌计数（图6E）。值得注意的是，P. goldsteinii的绝对计数（拷贝数）和相对水平均与肥胖性状负相关。9. P. goldsteinii可预防饮食诱导的肥胖和代谢紊乱
为了确认P. goldsteinii对HFD喂养小鼠的抗肥胖作用，采用P. goldsteinii或生理盐水处理HFD小鼠8周, 同时设立生理盐水处理的正常喂养小鼠为阴性对照（图7A）。结果显示：P. goldsteinii处理显著减轻HFD小鼠体重（20-35%的减少）及降低内脏脂肪重量、HOMA-IR指数、血清IL-1β和内毒素水平和肠道通透性（图7B-G），且结肠组织中IL-1β mRNA表达量降低，IL-10和ZO-1 mRNA 表达量增加（图7H）。P. goldsteinii处理还能有效地减少细胞单层破坏并恢复LPS处理的Caco-2细胞单层中的紧密连接ZO-1表达（图7I、J）。而在正常喂养小鼠中，P. goldsteinii处理可减轻小鼠体重，但不影响其他肥胖相关体征。研究总结

HSM多糖产物改善肥胖的主要机制是通过改变肠道菌群环境，其主要变化包括增加了革兰氏杆菌和其他新霉素敏感菌的水平，这种变化反过来又会提升高脂饮食小鼠的肠道完整性和胰岛素敏感性，并最终减少代谢性内毒素血症、炎症、脂肪沉积、脂肪组织病理及脂肪肝的发展，同时可以刺激机体发热，增加脂肪消耗。编者小评

本文对HSM这一中药的减肥作用机制进行了深入细致地探究，是研究肠道菌群与疾病或特定表型因果关系的优秀示范。作者从益生元出发，找到冬虫夏草菌丝体提取的大分子多糖H1对体重以及代谢的影响，并发现益生元对肠道菌群可能存在的影响，找到关键菌群P. goldsteinii，通过抗生素处理对益生元H1及菌群的影响作用，进一步揭示了HSM中大分子多糖H1与P. goldsteinii相互作用改善肥胖的主要机制。

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