单细胞RNA-seq(scRNA-seq)已经成为探究复杂组织中细胞类型、分子变化和细胞功能的重要手段。然而，单细胞技术要求从新鲜组织中制备单细胞悬液，获得较高的细胞活性和细胞质量，这是限制单细胞技术广泛应用的主要障碍。此时，医院、学校-80度冰箱里海量的冻存样本默默躺平了，课题组老师愁得发际线也后移了！
联川公众号在往期介绍了细胞/细胞核测序的差异，详见<如何选择snRNA-seq和scRNA-seq | 单细胞专题> 回顾一下，就是scRNA-seq适用于新鲜样本，但是对于含大细胞（>40um）组织、冻存组织就不适用了，另外scRNA-seq存在解离过程中细胞偏好性、应激基因非正常表达等问题。而snRNA-seq完美应用于含大细胞组织和冻存组织，另外像一些解离难度较大的特殊样本，如肝脏、胰腺、脂肪等，snRNA-seq比scRNA-seq效果更佳！但是snRNA-seq也存在检测基因少、免疫细胞占比低等问题。 聪明的看客已经明白，原来细胞核测序是那么强大！没错，小编拍胸脯表示：snRNA-seq能够完美应用于冻存样本的单细胞解决方案！
在Pubmed上检索“snRNA-seq”关键词，目前能够找到84篇见刊的单细胞核测序文章，其中2020、2021近两年占到了63篇，涉及到各类型组织。也就是说，snRNA-seq技术在近两年已经被研究人员广泛应用。考虑到尚有部分研究成果未见刊，见微知著，snRNA-seq的应用潜力巨大！小编整理了snRNA-seq应用于不同类型组织的文献列表：
列表：（滚动下方图片查看表格）
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2017年10月Nature Methods杂志发布了Broad研究所张锋团队开发的新技术——DroNc-seq单细胞表达谱分析技术，该技术融合了sNuc-seq技术与微流控技术的单细胞核RNA测序方法，可以在结构复杂的组织或者冻存组织中更有效地分析大量细胞/细胞核中的RNA，开启单细胞核测序的规模化时代。作者利用DroNc-seq对小鼠细胞系和脑组织进行了分析，并与Drop-seq、sNuc-seq以及其他较低通量的单细胞RNA-seq方法进行比较，结果显示DroNc-seq表现出了灵敏、高效且无偏向的细胞分类能力。该技术将为实现细胞图谱计划项目奠定了技术方案。
引自Habib N, et al. Nat Methods. 2017 Fig. 1
2019年1月J Am Soc Nephrol杂志，作者通过对小鼠炎症纤维化的肾脏进行scRNA-seq和snRNA-seq，确认后者比前者更具优势，主要体现在：①snRNA-seq捕获了更多的肾脏细胞，包括肾小球足细胞、系膜细胞和内皮细胞；②snRNA-seq未检测到应激反应基因的表达；③snRNA-seq鉴定到了罕见的细胞类型：表达增殖和损伤marker的两种近端小管细胞类群，以及促进/抑制肾纤维化的两种成纤维细胞类群。总结下来，就是snRNA-seq比scRNA-seq更能全面展示炎症纤维化肾脏的细胞特征和分子表达特征。
引自Wu H, et al. J Am Soc Nephrol. 2019 Fig. 2
2019年12月Nature Communications杂志，研究的是人视网膜，作者提出了困惑，临床上不容易拿到人视网膜样本，而且很难实现马上进行组织解离，所以细胞活性很难达到较高的水平。广大的临床研究人员是不是也面临同样的问题？另外，作者对解离本身也可能导致转录的变化表示担忧。因此作者选择了单细胞核测序，对三个冻存的人供体视网膜组织的外周和黄斑区的 snRNA-seq，鉴定到了视网膜中所有7种主要的细胞类型(杆状、锥状、MG、HC、HC、AC、BC和RGC)。为了进一步评估基因表达层面的准确性，作者同时进行了同类型组织的bulk RNA-seq，snRNA-seq和bulk RNA-seq非零基因的表达相关性达到了0.66~0.71。正如作者所说，snRNA-seq在冻存样本中研究细胞层面的表达谱具有很强的技术竞争力和稳定性。
引自Liang Q, et al. Nat Commun. 2019 Table 2; Fig. 2
2020年5月Natural Medicine杂志，作者研究的对象是非小细胞肺癌(NSCLC)、神经母细胞瘤(NB)、转移性乳腺癌(MBC)、胶质母细胞瘤(GBM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、卵巢癌、儿童肉瘤和黑色素瘤等8种类型肿瘤组织，比较了新鲜样本scRNA-seq和冻存样本snRNA-seq技术在细胞/细胞核质量，以及细胞组分等方面的差异，两种技术均非常完美地复现了各类肿瘤的细胞类型和分子表达。作者提到，snRNA-seq可以作为多种肿瘤研究的重要补充手段！
引自Slyper M, et al. Nat Med. 2020 Fig. 6
2021年2月bioRxiv预印本发布了由于感染SARS-CoV-2死亡的17例患者的11个器官的单细胞核图谱和空间转录组图谱，构建了COVID-19感染宿主的细胞图谱数据集，并揭示了组织病理和细胞分子机制，为新的治疗干预措施和预防策略提供支持。可见snRNA-seq技术在珍贵样本开展研究中的巨大潜力！
引自Delorey TM, et al. bioRxiv [Preprint]. 2021 Fig. 1
以上的文献背书表明，snRNA-seq技术应用场景主要涉及到冻存样本、难解离样本、珍贵样本等领域，具有不可替代的地位！鲁迅说过，真理来源于文献！有了文献支撑，我心里还没个底嘛！
snRNA-seq vs scRNA-seq数据质量比较（来源于联川测试数据）
目前联川已经测试了非常多的snRNA-seq的数据，细胞核测序在技术层面没有任何问题。以下展示了一批snRNA-seq vs scRNA-seq数据质量比较。该数据样本对象是小鼠大脑皮层，分别是3例抽核 vs 3例解离，基于10x Genomics平台进行细胞捕获，两种方式的测序数据比较如下：
可以看出，抽核和解离两种方式在捕获细胞/细胞核数量、平均细胞reads、基因中位数，以及检测的总基因数等方面相差不大。由于snRNA-seq会丢失细胞质中的转录本信息，从大量测试数据来看，snRNA-seq检测的细胞基因中位数或多或少会低于scRNA-seq的方式，不过Wu H, et al.(2019)表示scRNA-seq检测到的转录本高于24%来源于线粒体细胞器，或者由于酶解诱导的应激基因表达的转录本。从这个层面来说，snRNA-seq检测的基因信息并不逊色于scRNA-seq的方式。
从细胞类型可以看出，解离的方式会造成免疫细胞的比率增大，显示出细胞偏好性。相反，抽核能拿到更多的神经元细胞，能够反映组织最真实的细胞组分。因此，snRNA-seq有自身的优势，也可以作为scRNA-seq的互补手段，以实现全面描述组织最真实的细胞组分和基因表达状态（Slyper M, et al. Nat Med. 2020）。通过以上几个维度的描述，不知道看客们是否对snRNA-seq技术有新的认识？单细胞核测序是不是也很香！
那么，-80度冰箱里海量的冻存样本这个巨大的宝藏，还不抓紧时间去挖掘！
Slyper M, et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 2020 May;26(5):792-802.
Liang Q, et al. Single-nuclei RNA-seq on human retinal tissue provides improved transcriptome profiling. Nat Commun. 2019 Dec 17;10(1):5743.
Wu H, et al. Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis. J Am Soc Nephrol. 2019 Jan;30(1):23-32.
Habib N, et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nat Methods. 2017 Oct;14(10):955-958.
Delorey TM, et al. A single-cell and spatial atlas of autopsy tissues reveals pathology and cellular targets of SARS-CoV-2. bioRxiv [Preprint]. 2021 Feb 25:2021.02.25.430130.
蒋建国，联川生物市场部高级产品经理，为人端庄稳重有内涵，在高通量测序领域已深耕5年，拥有丰富的转录调控、表观组学、单细胞等产品的科研服务经验。目前主要负责联川生物单细胞产品的市场开拓、技术支持等工作。点击下方图片进入云平台资料汇总：
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