单细胞测序揭示B-ALL患者中耗竭T细胞的显著异质性（附细胞marker基因列表）| 单细胞专题

在进入正文前，小编告知小伙伴们一个振奋人心的消息：联川生物依托于海量的项目经验、文献和公共数据库，构建了自有细胞鉴定In-House Marker基因数据库（LC Auto Cell Type Marker，LC-ACTM），解决单细胞研究中“难鉴定、鉴定不全”的瓶颈问题，为单细胞数据挖掘提供强有力的保障！目前数据库仍在持续更新中，本文中关于肾组织细胞和亚型的Marker基因已被收录进LC-ACTM中，详见文末！

背景介绍

B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)是一种以B淋巴祖细胞异常增殖和聚集为特征的克隆性造血系统疾病。

传统的治疗策略中虽然化疗效果明显，但复发率高达60%，5年生存率仅30%，治疗效果有限。

近十年来，基于免疫的方法，如单克隆抗体治疗和检查点抑制剂等疗法出现，大大增强了癌症治疗的效果，其中CAR-T疗法效果尤为显著。

此外，随着研究的深入，人们意识到免疫疗法与免疫微环境关系密切。例如，CAR-T细胞治疗的疗效在不同患者之间并不一致，主要与衍生T细胞活性密切相关。

因此，加深对免疫治疗抑制状态和患者T细胞功能异质性的理解对于揭示新的治疗靶点至关重要。

许多检查点抑制剂的有效性在很大程度上取决于它们在微环境中减少CD8+细胞毒T细胞的能力，其细胞毒能力可能会因达到被称为耗竭的T细胞功能障碍状态而丧失活性。

耗竭的T细胞可以通过抑制性受体(CTLA-4、PD-1、TIGIT、LAG3、TIM3)的持续表达来定义。然而，耗竭T细胞以前与增殖能力的丧失有关，最近的研究提供了人类肿瘤内高度增殖的证据。

因此，深入研究白血病中积累的耗竭T细胞将为白血病的治疗和预后预测提供更好的策略。

结果

图 1技术路线

本文通过2个健康人（12669 Tcell）、3个B-ALL患者(16143 Tcell)共28842单个T细胞的转录本和T细胞受体(TCR)序列分析，鉴定了13个具有不同分子特性的独特T细胞亚群（图2）。

对耗竭T细胞的特征基因进行了详细研究，发现这些细胞主要来源于CD8+效应记忆/终末效应细胞，并在白血病中克隆性扩增。

这些数据可以作为研究白血病T细胞基本特征和潜在指导有效免疫治疗策略的宝贵资源。

图 2细胞聚类结果

B-ALL患者中鉴定出2种特异性耗竭性T细胞

皮尔逊相关性分析描述了健康人和B-ALL样本中T细胞之间的关系（图3）。

结果表明，耗竭性T细胞与CD4_TE、CD8_TE、CD8_EM、MAIT、γ-δT细胞聚集在一起，而这些T细胞群在体内都会产生直接的细胞毒性作用。

基于该结果可联想到耗竭性T细胞产生的潜在机制，耗竭性T细胞可能由这些T细胞转化而来？

图 3 T细胞群相关性聚类结果

不同T细胞亚型在B-ALL中表现出更多的活化特征

基于上述疑问，对T细胞亚群进行了细胞周期评分的分析（G0/G1, S, and G2/M）。

结果表明在健康人中，T细胞大部分保持在G0/G1状态，而在白血病样本中观察到相当一部分T细胞(≈20.4%)处于增殖状态，主要来源于CD4_Exhau和CD8_Exhau（图4）。

这一结果与最近的研究一致，表明耗竭 T 细胞是主要的增殖细胞。

图 4 T细胞细胞周期评分分析

由于在B-ALL患者中T细胞活性增强的原因尚不清楚，对各T细胞亚群进行了B-ALL与健康人的差异基因分析并进行功能富集。

结果发现，B-ALL患者中上调的基因主要富集到与抗原呈递(HLA-DQA1和HLA-DQB1)、T细胞激活(CD27和CTLA4)、细胞毒性(GNLY和GZMB)、癌基因激活(RHOA和CBLB）等功能。

表明处于白血病状态的T细胞被激活以上调其抗原提呈和免疫毒性，目的是去除白血病细胞。

图 5 B-ALL患者中T细胞上调差异基因功能富集

B-ALL患者耗竭T细胞的异质性

考虑到耗竭T细胞是白血病患者特有的且具有高度增殖的能力，同时PDCD1和LAG3也是免疫治疗的共同抑制受体和靶点，因此其可以作为重点研究的对象。

进一步对耗竭T细胞进行重聚类分析得到10个cluster（图6A），这些亚群在细胞周期状态、幼稚状态、耗竭状态、毒性表达等综合因素表达模式均不相同（图6C）。

EX_CCR7+和Ex_cc_CCR7+表现出较高的幼稚性和相对较低的细胞毒性评分，后者具有更高的增殖性。

后续将CD4+耗竭T细胞与其他CD4+T细胞，CD8+耗竭T细胞与其他CD8+T细胞比较，共获得28个耗竭特异性基因的列表（图6E）。

其中部分基因与癌症基因组图谱数据库中所收录的基因相吻合，提示了预后不良的作用，比如ITM2A与卵巢癌预后不良有关，可以做为白血病患者潜在的诊断和免疫治疗的生物标志物（图6F）。

图 6 耗竭T细胞亚群结果

TCR库显示B-ALL患者存在广泛的T细胞转化

抗原识别和克隆性T细胞的克隆性T细胞扩增是获得性免疫的关键，并且TCR可以作为T细胞的唯一标识符，因此对T细胞TCR信息的探究可以揭示T细胞的转化、克隆增殖的状态。

对B-ALL患者的T细胞进行了克隆性分析结果表明，白血病患者T细胞的克隆型更加多样，克隆性最高的cluster主要集中在CD8_TE和CD4_TE，表明白血病抗原暴露后免疫系统异常激活。

克隆扩增的克隆大小为2~273个，主要处于G0/G1期，高表达细胞毒性效应分子颗粒酶B和H(GZMB和GZMH)、FGFBP2、GNLY、NKG7、KLRD1和趋化因子(CCL5)，其中高克隆性扩张主要集中在CD4_TE、MAIT、CD8_TE、CD8_EM和耗竭性T细胞中（图7ABC）。

最终对各类型T细胞克隆性进行皮尔森相关性分析发现，CD8_EM与CD8_TE与耗竭性T细胞关系密切(图7F)，且这两个cluster与耗竭性的CD8+T细胞共享更多的克隆型(图7G)，因此耗竭性T细胞可能是由这些T细胞转化而来的。

图 7 不同亚型T细胞TCR特征

结语

至此，作者对文章的关键论点进行了全面的阐述。本文通过对白血病患者与健康人单细胞免疫组的分析，揭示了患者体内T细胞亚群的异质性。

并通过细胞周期评分、基因表达水平、细胞之间表达相关性、TCR克隆多样性等分析对T细胞亚群的讨论，表明了白血病患者体内特异性的耗竭性T细胞可能是由CD8_EM与CD8_TE等细胞毒性T细胞转化而来的。

最后，奉上这篇文献所采用的免疫T细胞相关的marker，已经收录进LC-ACTM中：

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