浅谈组织离体时长对单细胞转录组测序的影响 | 单细胞专题

引文

小红最近陷入了烦恼，前两天她和师兄都送了一批小鼠肾脏样本做单细胞测序，结果师兄的样本组织酶解后细胞活性很高（95%），可以进行后续的实验，而小红样本的细胞活性只有（60%）！明明是和师兄一起解剖的小鼠，用的试剂耗材都一样，步骤也完全一致，为什么结果会相差这么大呢？

小红很不解！思来想去似乎只有一个地方不同，那就是师兄解剖起小鼠来得心应手，3只小鼠，不到1小时就全部取完了样本。而自己因为是第一次上手解剖小鼠，单单是找肾脏就花费了不少时间，取好组织清理干净放到组织保存液中估计花费了快2个小时！

同样的组织，得出的结果大相径庭，是否就是因为操作的时间引起的呢？

单细胞测序需要较高的细胞活性，细胞只有所在的组织维持生命活动才能够维持存活。生命体一旦死亡，失去了系统提供氧和能量物质供应，组织在一定时间内就会死亡。其中的细胞也会相继死亡。存活的细胞可能被高度选择，它们的转录组会发生巨大的变化，降解的RNA导致数据质量不佳和生物学意义降低。

不同的细胞对于组织死亡后的缺氧耐受性不同，维持继续存活的时间也有所不同。下面我们针对几类常见的组织器官如肝脏、肾脏、脾脏、心脏等，分别阐述离体时间对RNA降解程度、RNA完整性等测序信息的影响。

视网膜

视网膜由五种主要神经元细胞类型和多达100种亚型组成，其中每种细胞类型都具有特定的RNA水平。视网膜RNA整体水平及细胞活力，细胞类型都会随PMI(postmortem interval，死亡间隔时间）增加发生一系列变化。

对视网膜组织，死后24h内，小鼠视网膜RIN值>7，且基本保持稳定，而狒狒视网膜RIN值仅在2.5左右，降解较多。在基因表达方面，与PMI为0 h相比，小鼠视网膜在死后15min，RNA表达即发生变化，且随着PMI增加，差异基因的数量也增加，24h变化最大；而狒狒mRNA表达水平在死后3h几乎没有变化，但在6h和24h发生了实质性变化（图1）。而在细胞活力方面，死后15小时内回收的视网膜组织细胞活力与PMI相关性较小，大于15h后细胞活性与PMI相关性增大且活性明显降低（图2）。

综合看来，对于视网膜组织，PMI在3到6小时内的视网膜样本影响相对较小，但不同物种之间可能会有区别。

图1：与零小时时间点相比，死后小鼠(左）和狒狒（右）视网膜中RIN值及差异表达的基因¹

图2：死后视网膜细胞活力变化²

脾脏

脾脏是胚胎时期的造血器官，具有滤血，免疫应答和造血等功能，富含各类免疫细胞，因脾是清楚衰老红细胞的主要场所，因此脾切除后，血内的异形衰老红细胞会大量增多。

死后，脾脏组织RNA稳定性相对比较高，死后20h，RIN值仍在6以上。同时，对脾脏组织PMI和RIN之间进行相关性分析显示，脾脏组织是受PMI影响较小的组织（r>-0.1）。在基因表达方面，在15h内，对五组不同PMI间隔下基因表达差异分析，相对其他组织，脾脏基因表达受时间间隔影响变化不大。

图3：室温下死后4h和20h收集组织的RQI值（和RIN值类似）³

图4：PMI和RIN相关性（左）以及各组织在至少两个时间间隔间显著变化的基因数（右）⁴

心脏

心脏是一个中空肌性器官，是心血管系统的动力泵。心壁内有由特殊心肌纤维组成的传导系统，其功能是发生冲动并将冲动传导到心脏的各部，使心房肌和心室肌按一定的节律收缩。

死后心脏组织保持相对较好的稳定性，在死后4h未观察到RIN水平的显著差异，在死后11h ，RIN>7。但心脏组织RNA稳定性与PMI存在显著相关性（p=0.0006），与立即收样冷冻保存的组织相比，随着PMI增加，RNA完整性也逐渐降低。在基因表达方面，心脏组织的基因表达的变化存在一个峰值，大约在6h左右。

图5：心脏样本中RNA完整性以及与PMI相关性³

图6：不同组织RIN值（X轴）随PMI（Y轴）变化⁵

（0：0h；1：≤12h；2：13-24h；3：25-34h；4：35-44h；5：≥45h）

图7：连续两个时间间隔间显著变化的基因热图⁴

皮肤

皮肤是人体中最大的器官，直接同外界环境接触。皮肤分表皮和真皮两层，表皮在皮肤表面，又可分成角质层和生发层两部分。真皮是致密结缔组织，有许多弹力纤维和胶原纤维，故有弹性和韧性。真皮比表皮厚，有丰富的血管、神经和多种免疫细胞。

根据文献报道小鼠死亡后在1时内分时选取皮肤组织，分离总RNA，并对每个标本的RNA完整性进行评估。在1小时内，28S/18S rRNA比值或RNA完整性数均无明显变化。通过实时定量PCR检测5个选定基因mRNA表达水平的变化。Ccnd1、Hif1α、cMyc和Cyr61的相关基因表达随死后时间的变化无统计学差异。文章数据表明皮肤组织的分子质量在死亡后至少60分钟内保持良好。

图8：小鼠皮肤总RNA与死后时间间隔的关系⁶

皮肤RNA的RIN值受PMI影响较小，另外在PMI15小时内的基因变化差异性不显著。

图9：PMI 和 RIN 值之间的 Pearson 相关性分布⁴

神经组织

神经组织是构成人体神经系统的主要成分，主要有神经细胞（神经元）和神经胶质细胞组成。神经元细胞形态多样，呈圆形、锥体形、梭形或星型，大小差异很大。在单细胞测序过程中多用抽核处理而不是酶解。

根据文献报道，神经受PMI的影响较小（见图8）。Nature曾报道在死后20h的脑组织中分离出神经祖细胞，多数细胞表现出一定的增殖能力。

图10：从死后人脑中分离的神经祖细胞⁷

肝脏

肝脏是脊椎动物体内已代谢功能为主的一个器官，在身体中肝脏主要去氧化、储存肝糖原、制造胆汁等一系列重要的生命活动。

针对肝癌和癌旁组织样本，离体半小时内的标本的 rRNA 比率≥1. 5，RIN≥6. 0，说明RNA 的完整性达到要求。离体40分钟和50分钟标本的rRNA比率≤1. 5，RIN≤6. 0，说明RNA 有降解，质量达不到要求。从RNA总量来看在室温 25 ℃环境下，肝癌及癌旁组织标本离体 30分钟以内，其RNA总量变化不大，离体40分钟后，其RNA总量发生较大变化。对不同离体时间的肝脏样本进行转录组测序发现在4小时内基因差异性不显著，在4小时后到15小时以上，基因改变显著。在小鼠肝脏中，mRNA随着死亡时间递增逐渐减少

图11：PMI对基因表达的影响⁴

图12：死后总 mRNA 丰度⁸

结肠

结肠是消化道中末端的组织，可以分为结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠4部分。结肠吸收水分，分泌粘液，但结肠的黏膜组织出现异常生长时会发展成为息肉和肿瘤。

不同时间在去世后病人中提取结肠组织的RNA发现，随着PMI时间增加RNA的RIN值和产量都显著降低。

图13：与心脏、肝脏、淋巴结和肾上腺的死后间隔相比，RNA 完整性的线性回归分析⁹

在死后的6小时，结肠组织的基因数量发生显著变化，其中参与RNA讲解的核糖核酸酶家族基因RNASE2在结肠组织中的表达持续下降。

图14：PMI对基因表达的影响⁴

卵巢、子宫、阴道

女性生殖系统包括卵巢、输卵管、子宫、阴道和外生殖器。其中卵巢是卵子发育和贮存的部位，也是分泌性激素的主要器官，子宫则是孕育胎儿的器官。

根据文献显示卵巢，子宫和阴道RNA的RIN值受到PMI的影响较大（见图8），其中子宫颈的完整性较低，部分样本未能产生完整的RNA。卵巢、子宫和阴道的线粒体RNA丰度随着PMI间隔加长，丰度显著降低

图15：PMI对线粒体转录和剪接的影响⁹

肾脏

肾脏是人体中一个重要的器官，其基本功能是生成尿液，借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物，同时经重吸收功能保留水分及其他有用物质，调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。另外肾脏还具备内分泌功能，，保证了机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行。

在机体死后检测肾脏的RNA完整性发现，当PMI时间延长，RNA完整性逐渐降低。

图16：不同尸检样本中的RNA完整性⁵

脑

大脑为神经系统最高级部分，由左、右两个大脑半球组成，两半球间有横行的神经纤维相联系。人的大脑皮层是大脑最为发达的器官，是高级神经活动的物质基础。人类大脑皮层主要含有锥体形细胞、梭形细胞和星形细胞（颗粒细胞）及神经纤维。

针对小鼠大脑组织在不同取样时间下mRNA的完整性及含量进行了研究，发现小鼠大脑mRNA在第一个小时内增加，然后逐渐下降。使用cRNA预估转录本降解情况，发现小鼠大脑转录本在0.5h开始就出现了显著的mRNA降解，且随着时间降解逐渐增强。

图17 不同PMI下小鼠大脑total RNA变化（左）  每个采样时间，从提取的cRNA的倒置浓度中减去活体对照提取的cRNA的mln g2 1中的倒置浓度的log2（右）⁸

其他研究也得到了相似的结果，人脑组织的RIN值与PMI呈现负相关，与人年龄、性别无关，长时间冷藏处理不会对人脑组织RIN值与RNA含量造成影响。

图18：PMI与(a) RIN和(b) RNA产率的相关性¹⁰

部分研究更加详细地针对大脑皮层和小脑组织PMI与RIN值的关系进行研究，其中脑组织保存在磷酸盐福尔马林溶液中，作者发现在36h之前PMI对无论是大脑皮层还是小脑RIN影响都很小。同时，作者比较了不同组织对RIN的影响，发现RNA在脑中的稳定性比在身体其他组织中的稳定性高。腰大肌、心脏和睾丸的RIN值比大脑低1个单位。从肝、肺和肾中提取的RNA降低了RIN值，而回肠和脾脏中的RNA有显著的降解。

图19：1068例供者大脑皮质(A)和小脑(B)PMI和RIN的变化不同组织在相同PMI后RIN值结果（右）¹¹

血液

血液是流动在人的血管和心脏中的一种红色不透明的黏稠液体。血液由血浆和血细胞组成，血细胞包括红细胞和白细胞和血小板三类细胞。血液的功能包含血细胞功能和血浆功能两部分，有运输、调节人体温度、防御、调节人体渗透压和酸碱平衡四个功能。

血液中RNA降解较与其他组织降解较快，有研究表明在PMI为5h时，血液样本中RNA就已经出现了明显的降解，且随着时间增加，RNA降解愈发剧烈。

图20：死后间隔(PMI)，每个病例的心肌组织(MT)、血液和心包液(PF)的mRNA提取率、吸光度比260/280(A260/A280)和RNA完整性数(RIN)的值⁹

总结

机体死亡后，不同组织样本对PMI的影响各不相同，诸如肝脏、卵巢、子宫、阴道、大脑、心脏等组织对外界条件变化敏感，受PMI的影响较大，建议最晚在机体死亡后的0~0.5h内放入组织保存液中进行妥善保存。神经、结肠、血液等组织，细胞状态较稳定，建议最迟在机体死亡后的0.5~1h内对其进行妥善保存。而视网膜、脾脏、皮肤等由于其组织特异性，可以在机体死亡后较长时间内保持细胞活性及RNA完整性，建议最迟在机体死亡后1-2h内对组织进行妥善保存。组织离体时间除了会造成RNA的降解之外，也会对转录图谱有影响。曾有文献报道在生物体死亡中，应激反应基因如热休克蛋白 ( Hsp )、缺氧相关、氧化应激的转录本预计会显着增加，这些基因在生命中被激活以应对扰动、恢复体内平衡和稳定细胞骨架。 这些改变都会对实验造成很大的影响，因此在做单细胞测序的过程中，机体死亡后尽量在0.5h内取出组织放置在保存液中，最迟不能超过2小时。

参考文献

1. Kallestad L, Blackshaw S, Khalil AM, Palczewski K. Tissue- and Species-Specific Patterns of RNA metabolism in Post-Mortem Mammalian Retina and Retinal Pigment Epithelium. Sci Rep. 2019;9(1):14821. Published 2019 Oct 15. doi:10.1038/s41598-019-51379-3

2. Lukowski SW, Lo CY, Sharov AA, et al. A single-cell transcriptome atlas of the adult human retina. EMBO J. 2019;38(18):e100811. doi:10.15252/embj.2018100811

3. Sampaio-Silva F, Magalhães T, Carvalho F, Dinis-Oliveira RJ, Silvestre R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval [published correction appears in PLoS One. 2013 Jun 18;8(6):null]. PLoS One. 2013;8(2):e56507. doi:10.1371/journal.pone.0056507

4. Ferreira PG, Muñoz-Aguirre M, Reverter F, et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes. Nat Commun. 2018;9(1):490. Published 2018 Feb 13. doi:10.1038/s41467-017-02772-x

5. van der Linden A, Blokker BM, Kap M, et al. Post-mortem tissue biopsies obtained at minimally invasive autopsy: an RNA-quality analysis [published correction appears in PLoS One. 2015;10(3):e0118969. Robertus, Jan L [added]]. PLoS One. 2014;9(12):e115675. Published 2014 Dec 22. doi:10.1371/journal.pone.0115675

6. Gopee NV, Howard PC. A time course study demonstrating RNA stability in postmortem skin. Exp Mol Pathol. 2007;83(1):4-10. doi:10.1016/j.yexmp.2006.11.001

7. Palmer TD, Schwartz PH, Taupin P, Kaspar B, Stein SA, Gage FH. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 2001;411(6833):42-43. doi:10.1038/35075141

8. Pozhitkov AE, Neme R, Domazet-Lošo T, et al. Tracing the dynamics of gene transcripts after organismal death. Open Biol. 2017;7(1):160267. doi:10.1098/rsob.160267

9. Walker DG, Whetzel AM, Serrano G, Sue LI, Lue LF, Beach TG. Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program. Cell Tissue Bank. 2016;17(3):361-375. doi:10.1007/s10561-016-9555-8

10. Birdsill AC, Walker DG, Lue L, Sue LI, Beach TG. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 2011;12(4):311-318. doi:10.1007/s10561-010-9210-8

11. White K, Yang P, Li L, Farshori A, Medina AE, Zielke HR. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreserv Biobank. 2018;16(2):148-157. doi:10.1089/bio.2017.0099

相关阅读

点击下方图片进入云平台资料汇总：

所见即所得，绘图高规格

联川云平台，让科研更自由