【直播回放】-80度冰箱里的宝藏，单细胞核测序也这么香（附细胞核提取实验方法）|单细胞专题

本月16号，蒋工（蒋建国）在哔哩哔哩平台分享了主题为“-80度冰箱里的宝藏，单细胞核测序也这么香！”的精彩直播，详细比较了单细胞vs单细胞核测序的差异、优劣势，以及应用场景。小伙伴们期待已久的录像视频，小编带来啦！

另外在视频后面，还附上了“细胞核提取实验详细方法”，欢迎大家浏览学习！

一、冻存组织的提核方法

（Habib N, et al. Nat Methods. 2017; Wu H, et al. J Am Soc Nephrol. 2019）

细胞核分离裂解液：采用EZ裂解缓冲液（NUC-101, Sigma-Aldrich），并添加蛋白酶抑制剂（5892791001, Roche）和RNase抑制剂（N2615, Promega和AM2696, Life Technologies）。

1. 将组织加到1ml EZ裂解液+1ml PBS混合液中，剪碎成~0.1 cm的小块，PBS管内沉降清洗2次，弃上清；

2. 加入2 ml预冷的裂解液冰上预裂解2min；

3. 用Dounce 匀浆器（885302-0002, Kimble Chase）进行匀浆，移液器温和地上下吹打匀浆5-6次；

4. 冰上孵育6min，加入2ml预冷的4% BSA稀释，巴氏吸管吹打6-8次，终止反应；

5. 4℃，300 g离心5min；

6. 用2 ml裂解液+4%BSA重悬，冰上孵育3min；

7. 去除碎片（Miltenyi）；

8. 沉淀采用4 ml上述裂解液+4%BSA缓冲液重悬，在冰上孵育5min。随后，4℃，300 g离心5min;

9. 细胞核沉淀缓冲液重悬（1× PBS，0.07% BSA和0.1% RNase抑制剂)；

10. 20um细胞筛（43-50020-50, pluriSelect）过滤细胞核悬液，收集最终的悬液，采用血细胞计数板或者Countess II自动细胞计数仪测浓度并计数，最适浓度调整为700-1200 nuclei/ul。

二、10x Genomics官方提核建议

1.概述

以细胞悬液和胚胎脑组织为例，介绍分离细胞核、清洗至计数的注意事项，适用于3’转录组抽核的应用，样本类型也可适用于细胞系、原代细胞、新鲜或者冻存的组织样本，但是根据细胞/组织类型的不同，所适宜的裂解时间以及RNase抑制剂的浓度等条件需要摸索。

2.试剂列表

3.实验方法

3.1试剂准备

a.适用于细胞悬液的 Lysis Buffer（现用现配，储存于4℃）

       b.适用于胚胎脑组织的 Lysis Buffer（现用现配，储存于4℃）

c.细胞核Wash & Resuspension Buffer（现用现配，储存于4℃）

d.其他试剂

LS Column Calibration Buffer (PBS + 0.5% BSA) (maintain at 4°C)（用于小鼠胚胎脑组织细胞核的分离）

蔗糖缓冲液I：2.7 ml Nuclei PURE 2M Sucrose Cushion Solution + 300 μl  Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer（用于小鼠脑组织细胞核的分离）

3.2 实验操作步骤

1. 对输入细胞悬液的要求

a.细胞活率>90%；

b.高比例的死细胞或濒死细胞会减少细胞核的得率；

c.环境RNA和细胞碎片的存在也可能影响细胞核分离结果。

2. 细胞裂解

a.对于特殊的样本类型，离心条件、清洗次数以及去碎片的方法均需要摸索和优化；

b.裂解孵育后用过显微镜观察，确定裂解效率；

c.处理新的细胞和样本类型时，需优化裂解时间；

d.避免过度裂解，可能会导致细胞核的聚合和结团；

e.裂解试剂需预冷，且裂解过程全程在冰上。

3. 清洗和重悬

a.用足够体积的Wash & Resuspension Buffer进行细胞核清洗和重悬，保持细胞核在Wash & Resuspension Buffer中的浓度<5000个/ µL，细胞核浓度过高能会导致细胞核的聚合和结团；

b.推荐的Wash & Resuspension Buffer中含有BSA是为了减少细胞核的结团及丢失，RNase Inhibitor是为了抑制提核过程中RNA酶的活性；

c.Wash & Resuspension Buffer中BSA和RNase Inhibitor的存在会导致用Recovery Agent.破油时，不会形成澄清的水相，而是半透明或不透明的状态，此现象正常可继续进行下游实验；

d.为避免细胞剪切和过早裂解，建议使用宽口枪头，而细胞核悬液有结团现象时，还需要使用常规枪头吹打以打破结团；

e.重悬细胞核过程注意慢且轻柔，以减少剪切力对细胞核造成的物理损伤。

4. 结团及碎片去除

a.选用适当大小的细胞筛对组织或悬液进行过滤，以去除细胞碎片和核结团现象，推荐使用美天旎30 µm细胞筛，会最小程度地影响细胞核的浓度，当然也会导致至少100 µL体积的损失。 

b.对于低浓度细胞核悬液，推荐使用 Flowmi Tip Strainer进行过滤，以减少体积损失。 

c.根据细胞核悬液的体积以及过滤器的不同，核浓度会降低40%，过滤前后需进行核浓度的精准计数。

d.当裂解神经元组织时，产生大量髓鞘碎片。 根据组织的年龄，髓鞘碎片的减少可以提高最终核制备的洁净度。推荐使用美天旎的Myelin Removal Beads II (Human, Mouse, Rat)结合预冷的试剂，用与死细胞去除同样的方法（只更换beads）进行髓鞘的去除。

5. 细胞核的观察与计数

a.在进行10x单细胞实验之前，需对细胞核悬液进行观察，以确定细胞核的浓度与活性、细胞核悬液的质量以及细胞核的大小；

b.当对某一样本类型进行第一次实验时，推荐使用两种不同的计数及测定活率的方法：

A. 台盼蓝染色：用台盼蓝对细胞核进行染色，用Countess II FL Automated Cell Counter进行细胞核浓度和活率的测定

B. 荧光染料染色：用荧光染料染色细胞核，用组织培养显微镜和自动细胞计数软件测量细胞活力

a.使用血球计数板计数可作为一种附加计数方法。

b.细胞核悬液的最佳输入浓度为700-1200个/ µL，推荐3-4次重复计数，标准偏差<25%，加入Master Mix中细胞核悬液的最佳体积在2.5-15 µL之间；当吸取体积<2.5 µL时会增加吸取误差导致的偏差，当吸取体积>15 µL会增加引入不必要的碎片或抑制剂的风险

6. Flow Cytometry

a.在样品浓度和体积允许的情况下，流式细胞术可以进一步提高悬浮液的纯度；

b.在显微镜下观察分选的细胞核，并在移入Master Mix之前使用细胞计数仪或血细胞计数板对细胞核悬液重新计数。基于流式细胞仪的细胞核计数是不准确的。  

7. 细胞核对照样本

为了评估以上方案的成功率与再现性，建议在每个实验样本的同时运行一个对照样本，对照样本建议用培养的细胞系(例如人类HEK293T细胞)：高质量(>90%活细胞)，并且产生足够数量的细胞核(> 1x10⁶个细胞核)

三、10x Genomics官方提核Q&A

Q: How can I run a lysis timeline to optimize nuclei isolation for 3' single-cell gene expression?

我如何确定裂解时间以优化细胞核分离？

A: 拥有高质量的核样本是实验成功的最重要的先决条件之一。优化样品在Lysis Buffer中时间的关键是确保大部分细胞膜被裂解，同时防止核膜的过度裂解，这会导致核内容物的泄漏和随后背景信号的增加。下面，提供一些指导方针，您可以针对您的特定样本类型确定裂解时间：

1）确定裂解的时间以及时间点的数量：

a. 针对单细胞悬液和敏感的组织类型，尝试的时间线较窄为最佳，如未裂解，1min, 2min, 3min, 4min......；

b. 针对较硬的组织类型，尝试的时间线可宽泛一些，如未裂解，2 min, 5 min, 10 min, 15 min ...。

2) 确定裂解液的最佳浓度：

a. 对于细胞系或已经在悬液中的细胞，我们建议以0.025% NP40为测试起点；

b. 对于新鲜的小鼠脑组织，我们的内部实验用0.1%的NP40进行。其他组织类型可能需要另外的浓度进行。

3) 裂解时间的执行

新鲜组织样本和细胞系：

a. 使用一个非贵重的样本，将你的细胞悬液(从细胞系或分离的组织中)分成多个等份，每个等份包含相同数量的细胞 ；

b. 每份都离心后去除上清，除未裂解对照外，均加入裂解液重悬；

c. 到达设定的不同裂解时间后，立即清洗并离心去除上清，用重悬液重悬后，用台盼蓝染色确定细胞活率和细胞核数量，显微镜40X下观察细胞核的质量

4) 以上同样的步骤重复进行，验证其他的裂解时间点

5) 确定最佳的裂解时间：当样品染色>95%死亡(<5%存活)，同时仍显示良好的核质量时，达到最佳的裂解时间

Q：Do I need to dissociate tissues into single cells first before isolating nuclei, or can I isolate nuclei directly from the whole tissue?

我是否需要在分离细胞核之前先将组织分离成单个细胞，还是直接从整个组织中分离细胞核?  

A：细胞核可以使用 Nuclei Isolation from Mouse Brain Tissue for Single Cell ATAC Sequencing (CG000212)提供的方案从组织中分离出来（用于ATAC），该方案概述了从新鲜组织、冷冻组织匀浆和整个冷冻组织中分离细胞核的流程。当决定选择哪个方案时，需要考虑一些因素，例如样品的性质（新鲜的，冷冻的），以及其他需要同时进行的分析。

例如，如果组织是新鲜的，并且可以很容易地分解成单个细胞悬液，那么建议使用解离，因为它能提供更多的细胞数量进行细胞裂解和细胞核分离。此外，如果有其他需要单细胞的检测(如转录检测、流式细胞术、磁珠筛选)，先将组织解离才可允许并行这些检测。

然而，如果组织很难分离，如纤维组织或冰冻组织，建议直接从组织中分离细胞核。

Q：Can I use an alternative RNase inhibitor part number?

我可以选择哪些RNase inhibitor？

A：不同的RNase抑制剂有不同的酶混合组分和酶活性，一些RNase抑制剂已经显示出cDNA产量的降低或对数据质量的负面影响。如下所示，Protector RNase inhibitor (Sigma, PN-3335399001)是推荐的酶抑制剂，换成了SUPERaseIn RNase inhibitor (Thermo Fisher, PN: AM2694)，后者的cDNA产率显著降低。 

以下RNase抑制剂的测试显示数据质量受影响:  

强烈建议Sigma Protector RNase inhibitor, PN-3335399001的RNA酶抑制剂。当然如果确实没有准备Sigma的RNA酶抑制剂，也可替换使用Ambion™ RNase Inhibitor (AM2684 Thermo Fisher Scientific), RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor (10777019 Thermo Fisher Scientific) 和RiboLock RNase Inhibitor (Thermo Fisher, PN-EO0382) 。

注意：这些抑制剂未用于多组学ATAC + mRNA实验的测试，所以使用时要谨慎。

Q: What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression?

细胞核样本进行3'单细胞基因表达实验有哪些注意细节?  

A:

1. 核质量判断

A：高质量核具有良好解析的边缘。单细胞基因表达文库的最佳质量。

B：细胞核完整，有少量起泡迹象。仍然可以产生高质量的单细胞基因表达文库。

C：具有强烈起泡迹象的核。有一定的实验风险。

D：核不再完整。不要继续实验！

2. 碎片和结团

细胞核粘在一起可能是过度裂解的迹象。细胞核悬液可以过滤以减少结团，也可以在清洗和重悬缓冲液中提高BSA的浓度到2%，以减少结块。 

3. Buffer: 在处理核样本时，在裂解、洗涤和重悬浮缓冲液中加入RNAse抑制剂是至关重要的。对于3' GEX实验，我们建议RNAse抑制剂浓度为0.2 U /ul。 

4. 细胞核纯化

有两个方法可以在细胞核分离后进行纯化：

a. 流式分选：帮助清除亚细胞碎片，聚集/团块和周围的RNA/DNA。用正向散射和侧向散射来排除核、双体、三联体等团块。对于无偏核种群，可以使用DAPI+种群完成排序。分类后的单核溶液应立即用于10x 3 '单细胞基因表达试验。应特别注意避免核损伤，因为分选可能会造成压力和破坏核膜，导致核内容的泄漏。

b. 使用碘克沙醇(OptiPrep™)或改良蔗糖梯度的密度梯度：这两种方法都可以用于清除细胞核准备，然而，正如文献报道的，碘克沙醇梯度比蔗糖梯度更可取。 蔗糖溶液粘性和高渗性更强，而碘克沙醇是等渗的，允许在等渗条件下细胞核分离。在使用Optiprep梯度后，应将细胞核洗3次，并在适当的缓冲液中重新悬浮，以确保所有碘克沙醇已被去除。

使用这两种方法，大约50%或更多的核损失，因此需要足够多的核起始量。 

5. 细胞核总量低：

增加离心时间或改变转子方向为水平

6. 计数

体积较小的核可能更难以计数。如果有大量的细胞碎片存在，这可能会进一步加剧，因为常见的计数染料，如台盼蓝也可以染色碎片。使用核酸染色荧光染料(如乙锭同型二聚体-1)和荧光自动计数器或显微镜可能有助于提高核计数的准确性，因为只有核酸将被染色而不是碎片。最好重复计数，以确保准确性。

7. 保存

不建议冷冻保存细胞核，因为冷冻会破坏细胞核膜。如果细胞核被冻结，它们就有可能破裂并增加背景信号。所以，需要尽快开展实验！

Q：What are the best practices for flow sorting cells for 10x Genomics assays?

10x Genomics单细胞实验的流式分选的操作建议有哪些?

A：流式细胞分选可以选择一个特定的感兴趣的细胞群体用于单细胞实验，建议在开始分选实验之前咨询有流式经验的人员。

下面是一些在进行单细胞实验前优化分选实验条件需考虑的一些因素，这些因素强调温和处理细胞以保证细胞的活性，这对10x实验的成功至关重要。流式细胞术中细胞的损失很常见，需要进行相应步骤的优化。

1）分选前

a. 确保收集管中有适当体积的缓冲液，以便在细胞接触时起到缓冲作用。  

b. 确保分选出的细胞悬液直接进入缓冲液中。

c. 确保鞘液和收集缓冲液与10x实验兼容。重要的是，不能包含EDTA或过量的Mg2+ (EDTA应小于0.1 mM，Mg2+小于3 mM)。

d.方案中应包含死细胞标记以去除死细胞。

2）分选中

a. 建议分选应以纯度为基准而非产量

b. 使用较大流量的喷(如100um的喷嘴，如果使用带喷嘴的分选仪)，或使用较低的压力分选细胞。在分选过程中使用较低的压力将有助于保持细胞的活性。

c. 在大多数情况下，最好选择较低的流量来保持细胞活性。如果感兴趣的细胞数量非常低(<0.01%)或已经分选了很多细胞，流速可能需要增加，以便分选的细胞在运行试验前不会停留很长一段时间。细胞在分选后会变得更加脆弱，分选后放置太久可能会导致存活率下降。

d.分选效率越高，分选结果越好。  

3）分选后

a. 排序后一定要进行细胞计数。细胞分选仪的计数往往是不准确的，所以建议在加载10x 表达谱芯片之前需要重新计数。

b. 在可能的情况下，分选细胞接收体积较小，建议可直接进入GEM生成的步骤。如有必要，收集的细胞可通过离心浓缩并去除上清。 根据目标细胞类型选择离心速度。对于脆弱的细胞，首选较长时间较慢速度的离心条件。

c.分选应迅速并柔和地使细胞进入GEM生成步骤。分选对细胞来说是有压力刺激的（可能诱导某些应激基因的表达），所以要尽量减少在冰上的时间。  

d.建议咨询一个流式专家的额外指导，以维持细胞活率。  

Q：How long can single cell or nuclei suspension be kept on ice?

单细胞或细胞核悬浮液能在冰上保存多久?

A：通常我们建议将细胞/细胞核加载到Master Mix中，并在样品制备后30分钟内运行芯片。这是因为细胞/细胞核在冰上停留很长一段时间可能会结块或溶解。转录组也可能受到影响。超过30分钟，不同样本的影响程度很评估。如果细胞/细胞核已经在冰上放置了很长一段时间，我们建议在标记实验之前重新计数并检查细胞的活率。

Q：I'm having trouble accurately counting nuclei. What can I do？

在精确计算细胞核方面有什么建议?

A：由于细胞核体积小，很难计数，如果有大量细胞碎片，则会进一步增加计数难度。使用核酸染色荧光染料可能有助于提高核计数的准确性，因为只有核酸将被染色而不是碎片。

注意，荧光染料的使用需要一个具有荧光功能的自动计数器或荧光显微镜。 

计数用染料推荐:

a. Ethidium homodimer-1: 仅细胞核染色，活细胞和碎片未染色

b. AO/PI: 碘化丙啶(PI)染色死亡细胞(即细胞核)，细胞碎片不染色

参考文献：

Habib N, Avraham-Davidi I, Basu A, Burks T, Shekhar K, Hofree M, Choudhury SR, Aguet F, Gelfand E, Ardlie K, Weitz DA, Rozenblatt-Rosen O, Zhang F, Regev A. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nat Methods. 2017 Oct;14(10):955-958.Wu H, Kirita Y, Donnelly EL, Humphreys BD. Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis. J Am Soc Nephrol. 2019 Jan;30(1):23-32.

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