神秘嘉宾亲译！空间转录组样本准备指南官方说明书-Part 3（组织染色与透化时间摸索） | 空间转录组专题

空间转录组冷冻切片染色及透化时间测试

我们根据10x Genomics实验指南CG000240和CG000160，整理了冷冻切片后H&E染色及透化时间测试的实验流程。进行这一步的实验，需要预先将冷冻切片按照要求贴在组织透化芯片的捕获位置，并添加RNA标准品作为阳性对照。以下是实验操作流程。

1. 固定及H&E染色

（1）提前在50ml离心管中加入甲醇并在20℃下预冷；PCR仪安装Visium适配器，37℃预热；

（2）在50ml离心管中加满Milli-Q水，同时准备3个1L烧杯，每个烧杯中加入800ml Milli-Q水，编号为烧杯1,2 3；

（3）按如下配方准备洋红混合液；

（4）将玻片放在PCR仪适配器上，37℃孵育1 min；

（5）将玻片从适配器上取下，完全浸入预冷的甲醇中，-20℃孵育30 min；

（6）取出玻片，用吸水纸擦干玻片背面的液体，放置玻片在干净平整的工作台面上，滴加500ul异戊醇覆盖切片，室温下孵育1 min；

（7）倾倒玻片上多余的液体至50ml离心管中，用吸水纸擦干玻片背面，晾干玻片；5 min后检查玻片晾干程度，晾干时间不要超过10min；

（8）将玻片放在干净平整的工作台面上，加入1ml苏木精，室温下孵育7 min；

（9）倾倒多余的苏木精染料至50ml离心管中，用吸水纸吸干玻片背面多余的液体；

（10）玻片在50ml离心管中重复“浸入-取出”动作5次；

（11）玻片在烧杯1中重复“浸入-取出”动作15次；

（12）玻片在烧杯2中重复“浸入-取出”动作15次；

（13）倾倒玻片上多余的苏木精染料至50ml离心管中，用吸水纸吸干玻片背面的多余液体，然后玻片浸入无酶水清洗，晾干；

（14）加入1ml Bluing Buffer, 室温孵育2 min；

（15）倾倒玻片上多余的Bluing Buffer至50ml离心管中，擦干玻片背面液体；

（16）玻片在烧杯2中重复“浸入-取出”动作5次；

（17）擦干玻片背面的液体；

（18）将玻片放在干净平整的工作台面上，加入1ml 伊红混合物溶液（注意区别FFPE切片使用的伊红酒精溶液），室温孵育1min；

（19）倾倒多余的伊红染料至50 ml离心管中，用吸水纸擦去玻片背面的多余液体；

（20）玻片在烧杯3中重复“浸入-取出”动作15次；

（21）擦干玻片背面的水分，放在干净平整的工作台面上自然风干，直至组织变得不再透明；

（22）在PCR仪适配器上，37℃孵育1min，直接进行后续的明场实验。

2. 封片（根据显微镜的说明决定是否需要此步骤）

在覆盖盖玻片之前，确保玻片表面的切片是干燥的。可以将玻片放在适配器上，37℃上孵育1 min。

准备如下试剂和耗材

（1）将玻片放在干净平整的工作台面上；

（2）向每个样本加入200ul 的Mounting Medium，确保每个样本都被其均匀覆盖；

（3）使盖玻片末端与玻片接触呈一定角度，轻缓地放下玻片，注意不要引入气泡，使甘油溶液缓慢散开并定型。若甘油过量，小心用吸水纸在盖玻片边缘吸去，注意不要移动盖玻片；

（4）用吸水纸在玻片背面吸去多余液体，不要接触组织切片；

（5）缓缓前后作用倾斜玻片，直至玻片完全固定。

3. 去盖玻片（若已加盖盖玻片）

（1）在1L烧杯中加入800ml 3X SSC Buffer。

（2）将玻片按长端方向浸入烧杯直至完全浸没，用手拿住玻片，直至盖玻片缓慢完全脱落。为了保证切片完整，注意不要上下移动或剧烈摇晃玻片，也不要用手直接剥去盖玻片。

（3）将玻片在1L烧杯中轻柔重复“浸入-取出”过程15次以洗去多余的甘油。

（4）用吸水纸在玻片背面吸去多余液体，不要接触组织切片。

4. 组织透化时间摸索

（1）将芯片放在芯片盒中，阳性和阴性对照均不加透化酶；

（2）在透化30min中的孔中添加70ul透化酶，并在37℃的PCR适配器上孵育；

（3）6分钟后，向透化24min的孔中添加70uL通透酶，并在37℃的PCR适配器上孵育；

（4）重复此过程，直至27min后，向透化3min的孔添加70uL透化酶，放置在37℃的PCR适配器上；

（5）从每个孔中除去透化酶，阳性对照以外的所有孔中添加100ul 0.1X SSC；

（6）从每个孔中移除0.1X SSC。向每个孔中加入50ul Fluorescent RT Master Mix，将其放在53℃预热的PCR 仪以启动cDNA合成；

（7）从孔中洗出Fluorescent RT Master Mix，

（8）向每个孔中添加100 uL 0.1 X SSC；

（9）从每个孔中吸出0.1X SSC；

（10）重复步骤（8）（9）一次；

（11）向每个孔中加入70uL Tissue Removal Mix，然后放在56℃预热的PCR仪适配器上孵育60 min；

（12）从孔中洗出Tissue Removal Mix。从芯片盒中取出芯片，浸入装有45 ml 50℃预热的2X SSC-0.1% SDS离心管中15次， 浸入装有45 ml 50℃预热的0.2X SSC中15次，浸入45 ml 50℃预热的0.1X SSC中15次；

（13）在载片旋转器中离心30s，确认芯片上没有剩余的组织；

（14）在数字切片扫描仪在荧光场下进行扫描成像，选择合适的透化时间。一般应选择荧光最亮的透化时间。若荧光强度接近，还应考虑是否发生RNA弥散现象，因为RNA弥散会使后续的空间染色组定位信息出现偏差。

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号外号外！周四晚19:30翻译本篇文章的神秘嘉宾将会在bilibili直播讲解空间转录组实验技术原理和具体的操作步骤，大家可以期待一下哦！

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