神秘嘉宾亲译！空间转录组样本准备指南官方说明书-Part 4（组织透化与测序建库） | 空间转录组专题
空间染色组组织透化与测序建库
完成H&E染色质检及透化时间测试后，就可以根据确定的最佳透化时间，进行正式的空间转录组建库实验了。我们根据10x Genomics实验操作指南CG000239，整理了如下的空间转录组透化及测序建库实验操作流程。实验开始前，需要将组织切片按要求贴在空间转录组表达芯片的捕获区域上。
1. 组织透化
提前准备好如下试剂及配件，试剂按需求调整到相应的温度
（1）在PCR仪上放置适配器，按如下的程序设置PCR；
（2）将芯片放在芯片盒中，向每个孔中添加70ul透化酶，并在37℃的PCR适配器上，按透化摸索实验中确定的最佳时间孵育；
（3）孵育结束后，从每个孔中除去透化酶，向每个孔中添加100ul 0.1X SSC；
2. 反转录
（1）将适配器放在PCR仪上预热，按如下参数设置PCR以备后续反应；
（2）按下表准备RT Master Mix on ice，移液枪吹打混匀10次+短离心；
（3）从每个小孔中吸去0.1X SSC；
（4）向每个小孔中加入75ul RT Master Mix；
（5）用封口膜封住芯片盒，放在PCR仪适配器上，盖上PCR仪的盖子；
（6）53℃孵育45 min。
3. cDNA第二链合成
（1）按下表准备试剂及耗材；
（2）反转录结束后，从PCR仪上取下芯片盒，放在干净平整的工作台面上；
（3）按如下程序设置PCR仪，以备后续反应；
（4）吸去每个小孔中的RT Master Mix；
（5）向每个小孔中加入75ul 0.08 M KOH；
（6）室温下孵育5min；
（7）吸去每个小孔中的KOH溶液；
（8）向每个小孔中加入100ul Buffer EB；
（9）按下表在冰上准备cDNA第二链合成混合液（Second Strand Mix），涡旋振荡+短离心；
（10）吸去每个小孔中的Buffer EB;
（11）用封口膜封住芯片盒，放入适配器中进行反应，65℃下孵育15min。
4. 变性
（1）第二链合成结束后，取下芯片盒，揭开封口膜，吸去每个小孔中的溶液；
（2）向每个小孔中加入100ul Buffer EB；
（3）用移液枪吸去每个小孔中的Buffer EB；
（4）向每个小孔中加入35 ul 0.08 M KOH溶液；
（5）室温下孵育10 min；
（6）加入5ul Tris （1M, pH 7.0）至8联排PCR管中的至多四管（2管用于每个Visium Gateway Gene Expression Slide；4管用于每个 Visium Spatial Gene Expression Slide）；
（7）从小孔中吸取35 ul 样品，加入每个含有Tris溶液的PCR管中，成为40ul 体系；
（8）涡旋振荡，短离心，置于冰上；
5. cDNA扩增
（1）开始前准备好如下试剂耗材及仪器，试剂根据后续实验需要，调整到相应的温度；
（2）按下表在冰上准备qPCR Mix，涡旋振荡+短离心；
（3）向qPCR板中的每管加入9ul qPCR Mix, 可留有一管用于阴性对照；
（4）向含有qPCR Mix的每管加入1ul变性后的样品；移液枪吹打混匀，短离心；向阴性对照加入1ul nuclease-free water；
（5）按下表参数设置qPCR system，开始qPCR反应；
（6）记录每个反应的Cq值，Cq值大致位于荧光反应峰值的25%，即指数阶段的起始位置；
6. cDNA扩增
（1）按下表在冰上准备cDNA扩增混合液（cDNA Amplification Mix），涡旋振荡+短离心；
（2）向步骤4（变性）剩余的样本（~35ul）加入65ul cDNA Amplification Mix，用移液枪吹打混匀，短离心；
（3）按如下参数设置PCR仪以备后续反应；
循环数根据qPCR值确定的Cq值四舍五入
（4）反应结束后，可在4℃下保存至多72h或-20℃保存至多一周，或直接进入下步反应。
7. cDNA Cleanup - SPRIselect（片段筛选I）
（1）涡旋振荡重悬SPRIselect试剂。向100ul样品加入60ul SPRIselect试剂（0.6X），用移液枪吹打混匀15次；
（2）室温下孵育5min；
（3）将PCR管放在magnet·High上直至溶液澄清；
（4）弃上清；
（5）加入200ul 80%乙醇至磁珠，静置30s；
（6）弃乙醇溶液；
（7）重复步骤（5）（6）一次；
（8）短离心，将PCR管放在magnet·Low上；
（9）吸去多余的酒精，风干2min。不要风干过长以免影响洗脱效率；
（10）将PCR管从magnet·Low上取下，加入40.5ul Buffer EB。移液枪吹打混匀15次；
（11）室温下放置2min；
（12）将PCR管放在magnet·Low上直至溶液澄清；
（13）转移40ul样品至新的八联排PCR管中；
（14）立即进行下步实验。如需保存，4℃保存至多72h 或-20℃至多一周。
8. 片段化，末端修复，加A反应
（1）按如下参数设置PCR仪，以备后续反应；
（2）按下表在冰上准备片段化混合液（Fragmentation Mix）。吹打混匀，短离心；
（3）转移10ul 步骤7中得到的样品到PCR管中，冰上保存；剩余的~30 ul样品可以在-20℃中保存至多四周备用；
（4）向每个样品中加入25ul Buffer EB；
（5）向每个样品中加入15ul Fragmentation Mix;
（6）用移液枪吹打混匀15次，短离心；
（7）转移样品至提前预冷好的PCR仪上；32℃孵育5min；
9. 片段筛选II（SPRIselect）
（1）涡旋振荡SPRIselect试剂。每个样本中加入30ul SPRIselect（0.6X）试剂。移液枪吹打混匀15次。
（2）室温下孵育5min；
（3）将PCR管放在magnet·High上直至溶液澄清，不要弃去上清；
（4）转移75ul 上清至新的八联排PCR管；
（5）涡旋振荡SPRIselect试剂。每个样本中加入30ul SPRIselect（0.8X）试剂。移液枪吹打混匀15次。
（6）室温下孵育5min；
（7）将PCR管放在magnet·High上直至溶液澄清，不要弃去上清；
（8）吸去80ul 上清，不要吸走任何磁珠；
（9）加入125ul 80%乙醇至磁珠，静置30s；
（10）重复步骤（8）（9）一次；
（11）短离心；将PCR板放置在magnet·Low上直至溶液澄清；去除多余的酒精，不要过分干燥影响洗脱效率；
（12）从magnet·Low上取下PCR管，向每个样本中加入50.5ul Buffer EB。移液枪吹打混匀15次；
（13）室温下孵育2min；
（14）将PCR板放置在magnet·Low上直至溶液澄清；
（15）转移50ul样品至新的8联排PCR管；
10. 加接头
（1）按下表配置接头连接混合液（Adaptor Ligation Mix）。吹打混匀，短离心；
（2）向每个样品中加入50ul Adaptor Ligation Mix。吹打混匀15次，短离心；
（3）按以下参数在PCR仪上孵育样品。
11. 片段筛选III
（1）涡旋振荡SPRIselect试剂。每个样本中加入30ul SPRIselect（0.8X）试剂。移液枪吹打混匀15次。
（2）室温下孵育5min；
（3）将PCR管放在magnet·High上直至溶液澄清；
（4）弃上清；
（5）短离心，将PCR管放在magnet·Low上；
（6）吸去多余的酒精，风干2min。不要风干过长以免影响洗脱效率；
（7）将PCR管从magnet·Low上取下，加入30.5ul Buffer EB。移液枪吹打混匀15次；
（8）室温下放置2min；
（9）将PCR管放在magnet·Low上直至溶液澄清；
（10）转移30ul样品至新的八联排PCR管中；
12. Sample Index PCR
（1）选择合适的sample index；
（2）向30ul样品中加入50ul Amp Mix；
（3）向每个孔中加入20ul Dual Index TT Set A，记录每个样品孔的ID。吹打混匀5次，短离心；
（4）按如下参数设置PCR仪，进行PCR反应；循环数根据Cq值四舍五入；
（5）进入下步反应或者4℃保存至多72h。
13. 片段筛选IV
（1）涡旋振荡SPRIselect试剂。每个样本中加入30ul SPRIselect（0.6X）试剂。移液枪吹打混匀15次。
（2）室温下孵育5min；
（3）将PCR管放在magnet·High上直至溶液澄清，不要弃去上清；
（4）转移150ul 上清至新的八联排PCR管；
（5）涡旋振荡SPRIselect试剂。每个样本中加入20ul SPRIselect（0.8X）试剂。移液枪吹打混匀15次。
（6）室温下孵育5min；
（7）将PCR管放在magnet·High上直至溶液澄清，不要弃去上清；
（8）吸去165ul 上清，不要吸走任何磁珠；
（9）保持PCR板在magnet·High上，加入200ul 80%乙醇至磁珠，静置30s；
（10）重复步骤（8）（9）一次；
（11）短离心；将PCR板放置在magnet·Low上直至溶液澄清；去除多余的酒精；
（12）从magnet·Low上取下PCR管，向每个样本中加入35.5ul Buffer EB。移液枪吹打混匀15次；
（13）室温下孵育2min；
（14）将PCR板放置在magnet·Low上直至溶液澄清；
（15）转移35ul样品至新的8联排PCR管；
（16）4℃保存至多72h或-20℃长期保存；
完成上述步骤后，就可以在illumina测序仪上进行后续的测序工作。
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