流式细胞术在植物及植物单细胞测序中的应用 | 流式专题

流式细胞术是一种对细胞群体中的单个细胞或类似细胞大小的颗粒进行快速连续检测的技术。其基本原理是: 通过基于层流规律的流体动力学聚焦将单细胞队列快速传输通过激光照射的探测点，细胞被照射而产生各种光信号，包括多角度散射光和细胞携带的各种荧光染料被激发发出的特征荧光，每个细胞产生一套关联的散射光和荧光信号，机器收集和分析多个单细胞的散射光和荧光信号，仪器收集、测量众多单细胞的散射光和荧光信号并进行关联分析^[1]

流式细胞术基本结构图

流式细胞技术最主要的特点是：①检测速度快，理论上流式细胞术能够在1s内检测数十万个悬浮粒子②检测参数多，即该仪器可以同时检测一个悬浮粒子的多种参数③该仪器还可在快速分析的前提下对粒子同时进行准确分选④用途广泛，即流式细胞术集合了多种技术于一体，拥有较强的分析和分选能力，故有较强大的功能和广阔的应用空间^[2]

一、流式细胞术在植物学中的应用

植物的细胞结构与动物细胞结构是有较大差异的，植物细胞含细胞壁、叶绿体以及质体等细胞器，成熟的植物细胞还有液泡结构，一个群体内，单个细胞之间也会存在生长率、生长活性以及次级代谢产物合成能力有差异现象；流式细胞术可以解决植物的这个问题，并在植物中研究也有广泛的应用，比如应用流式细胞术对植物细胞核及倍性分析、植物染色体分析和对植物原生质体的分析。

1.植物细胞核及倍性分析

核型分析作为传统方法常被用来分析植物细胞核及染色体倍性。传统的方法对材料要求较高，需要使用处于分裂中期的组织，不仅费事费力，而且需要过强的实验经验和操作技术。另外，材料的获取难度也比较大。流式细胞术的出现帮助解决了这一问题。

因细胞核内 DNA 含量同倍性存在一定的关系，我们可利用流式细胞术结合DNA含量差异完成植物染色体倍性的分析，不仅简化了分析方法，而且不需要制备分裂中期的细胞因该实验方法简单、快捷、准确，流式细胞技术很快被众多学者所接受^[3]。

2.植物染色体分析和分选

流式细胞术在植物染色体分析方面的应用主要包括性染色体鉴定和染色体分选。性染色体的鉴定是利用该仪器检测性别不同的植株 DNA含量，在分布直方图中寻找不重叠的DNA峰，来确定植株性别。目前有关这方面的研究较少，但是有成功的先例，如前人已通过流式细胞术鉴定了芦笋的雄性植株以及二倍体的超级雄性植株^[4]。郭东伟（2008）等利用流式细胞术已完成对小麦特定染色体的分选及染色体的相关鉴定工作^[5]。

3.原生质体分析

流式细胞术可以用来分选植物染色体，帮助建立有关基因组的物理图谱。流式细胞术在原生质体分析方面应用也比较广泛，主要用来分析原生质体结构、膜表面蛋白表达、原生质体内标记物的表达情况、细胞融合后的产物情况等。

Liu利用流式细胞术对甜橙胚性愈伤组织原生质体和酸橙叶肉原生质体融合后再生的体细胞进行分析，发现融合原生质体再生的植株荧光强度是对照的两倍，证明两种材料的原生质体充分融合^[6]。

Guzzo等利用分析经enod40转染的原生质体的流式细胞术可以用来分选植物染色体，建立了基因组的物理图谱,并利用流式细胞技术分析经enod40转染的原生质体发现引起细胞变小的基因表达，说明enod40对原生质体有重要影响^[7]。

二、流式细胞术在植物单细胞中的应用

流式细胞术不仅仅可以用于植物细胞核及倍性分析、植物染色体分析和分选和原生质体的分析，也可以做为植物单细胞测序中非常重要的验证手段。

作物产量取决于植株结构(包括玉米穗结构)的分生组织的活动。对发育的全面理解需要洞察细胞类型和发育的复杂性。作者主要研究了玉米穗发育过程中12525个单细胞的转录组，构建了花序的单细胞图谱。并通过mRNA原位杂交和荧光激活细胞分选(FACS) 进行了验证，并可以通过预测遗传冗余、整合转录网络和识别来识别出作物产量性状相关的候选基因。

1. 玉米穗原生质体的分离和构建单细胞转录组图谱

(A)所示:实验设计，第一张是5 - 10毫米发育中的玉米穗(比例尺= 2毫米)的扫描电镜图像，第二张是玉米穗原生质体的图像(B)通过单细胞RNA-seq数据集确定了12个cluster(C)每个点代表一个细胞。标记基因的UMAP图，颜色标度表示标准化表达水平(D) KN1，分生组织，除3和6外的所有cluster(E) BD1，分生组织边界，9 cluster(F) BA1，近轴分生组织外围，11 cluster(G) RA3，分生组织基地，10 cluster(H) ZmHDZIV8，表皮，6 cluster和3cluster(1) ZmYAB14，决定性外侧器官，meta-cluster 3(J) ZmTMO5，木质部，4cluster(K) ZmAPL，韧皮部，5 cluster(L) ZmSHR1，维管束鞘，12 cluster(M) GRMZM2G345700 (2G345700)，皮层, meta-cluster 1(N) ZmNAC122, meta-cluster(O)小穗分生组织纵切面(左图)和维管束横切面(右图)显示了scRNA-seq元簇中的细胞/结构域一致性。

二、原位mRNA杂交和FACS RNA-seq验证scRNA-seq

(A)每个cluster的前两个标记基因用圆点图表示表达该标记的细胞百分比，颜色表示z_score表达值。(B) ZmMIPS2，分生组织边界(C) ZmGST41，分生组织边界（9 cluster)和束鞘（12 cluster)，红色箭头(D和E) ZmDI19 (D)和ZmPAO1 (E)，近轴分生组织外围(F和G) MFS18 (F)和ZmPLTP3 (G)、分生组织表皮(meta-cluster 6)和外侧器官表皮(meta-cluster 3)(J) ZmTMO5- LIKE3，木质部(红色箭头表示木质部导管)(K) ZmZNF30，韧皮部。(L) ZmCYCB2-4，细胞周期G2/M期(M) ZmHIS2A，细胞周期S期。比例尺= 100 mm(N)利用FACS从pZmYAB14- TagRFPt中采集RFP原生质体。比例尺= 100毫米。3个生物重复进行FACS RNA-seq(O)在FACS RNAseq中，RFP和总对照原生质体(Cntrol)之间标记物ZmYAB基因和KN1的Log2(fold change(FC))(P)火山图是pZmYAB14- TagRFPt FACS RNA-seq标记(红点)在3cluster的scRNA-seq差异表达(DE)基因。x轴表示3cluster与所有其他cluster之间DE基因的平均log2(FC)。Y轴为对应的-log10(p-value)。(Q) pZmYAB14-TagRFPt FACS RNA-seq和scRNA-seq Meta-cluster 3差异基因表达的一致性(R) pZmYAB14-TagRFPt FACS分类细胞中，Meta-cluster 3 DE基因富集在开放染色质中

 总结：作者通过单细胞测序的方式构建了玉米穗原生质体的分离和构建单细胞转录组图谱，为了鉴定原生质体应答基因，作者首先将Tu阴性对照原生质体装入FACSAria II SORP中，建立识别自身荧光信号的门。然后使用相同的设置加载Tu原生质体。根据mStrawberry通道的特异性信号采集RFP细胞，在ZEISS lsm710共聚焦显微镜下观察。提取RFP阳性原生质体样品和对照样品的RNA。并使用SMART-Seq v4和Nextera XT DNA Library Prep Kit构建RNA-seq文库和进行高通量测序。通过原位mRNA杂交和FACS RNA-seq完成原生质体应答基因的验证工作。

 以上就是分享流式细胞术在植物中的应用及植物单细胞的验证的使用案例，希望为后续结合流式细胞术研究植物或者植物单细胞提供一些帮助和思路。

参考文献:
[1]杭海英,刘春春,任丹丹,流式细胞术的发展、应用及前景[J]中国生物工程杂志 China Biotechnology,2019,9(9):68-83
[2]NunezR.2001.DNAmeasurementandcellcycleanalysisbyflowcytometry.CurrIssuesMolBiol,3(3):67-70
[3]Ochatt S T.2008.Flow cytometry in plant breeding. Cytometry Part A,73A:581-698
[4]Delaitre C,Ochatt S,Deleury E.2001.Electroporation modulates the embryogénie responses of asparagus (asparagus officinalis l.) microspores.Protoplasma,216:39-46
[5]郭东伟,胡甘,佘茂云等.小麦流式分选染色体的鉴定[J]作物学报2008,34(1):89−94
[6]Liu J H. 2004. Characterization of Nuclear and Cytoplasmic Compositions of Somatic Hybrid Plants Between Sweet Orange and Sour Orange.Acta Botanica Sinica,46(10):1206-1211
[7]GuzzoF,PortaluppiP,Grisi R, Barone S,ZampieriS,FranssenH,LeviM.2005.Reductionofcellsize induced by enod40 in Arabidopsisthaliana.J exper bot,56(412):507-513

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