血浆血清蛋白质组学研究需知！Olink+质谱是解决血浆血清蛋白种类复杂的最优解？？

一、选择血浆还是血清开展蛋白质组学？
1．全血、血浆、血清傻傻分不清？

血浆和血清哪一种做蛋白质组学更好？都有什么区别？要解决这个问题的困惑，我们还是要系统复习下全血、血浆、血清的区别

全血：全血是一般是指人体血液被采集到采血袋内后形成的混合物，全血包括了血细胞和血浆的所有成分。

血清：血清是指不经抗凝处理的全血在放置一段时间后，血液在一系列凝血因子的作用下自主凝集，然后经过离心沉淀，血液中凝固的成分就会与一些淡黄色的清澈液体分开，这些分离所得的清澈液体就称为血清。

血浆：血浆是全血经抗凝处理后，在离心沉淀机经过离心沉淀后得到不含细胞的液体，其形态呈浅黄色半透明液体。

 （图片来源网络，侵权删除）

通常我们所说的全血包含了血浆和红细胞、白细胞、血小板以及其他的小的细胞，而当血液在凝固的过程中，血浆中的纤维蛋白原会变成纤维蛋白，进一步将红细胞凝固起来，形成血凝块，而上层析出的液体就是血清。

不同的临床指标的检测，用到血浆、血清和血浆也是不一样的，比如做血常规检测是全血检测，血生化、肿瘤标志物检测需要用血清，针对凝血因子的检测，需要用上血浆。而临床上很多相关检查的指标大多是用血清中某些浓度来进行，就这点相对而言，血清的临床范围应用更为广泛。

全血、血浆、血清的包含关系（图）

总结如下：

全血包含血浆和血细胞，血细胞包含红细胞、白细胞和血小板，血浆的92%都是水分，还有些血浆蛋白和其它固体成分，其中血清和血浆主要的区别在于血清中不含纤维蛋白原，血浆和全血的区别在于血浆不含血细胞。2.血清、血浆蛋白质组学研究

人血液中的蛋白质是非常重要的，几乎与所有的器官、组织、细胞息息相关，并且可以从蛋白的性质直接反映机体的病理、生理状态，大部分的和疾病相关的标志物都和血液中的蛋白相关。血浆蛋白质组也是最复杂的人类蛋白质组，一直以来也是人们研究的热点，血液蛋白质组学被国际人类蛋白质组组织(Human Proteome Organization, HUPO) 列为首批实施的重大国际合作项目，在2002年正式启动了人类血浆蛋白质组计划（Plasma Proteome Project，PPP）。人类血浆蛋白质组计划致力于解决①优化血浆、血清蛋白质组研究的各种技术手段，建立血浆、血清蛋白质组研究的技术平台。②描绘人类血液蛋白质图谱。

血浆、血清蛋白质组学是蛋白质组学研究的一个重要分支，通过选定的目标人群检测血浆、血清中表达的全部蛋白质，并寻找其差异蛋白，鉴定和疾病相关蛋白质，为研究重大疾病病理生理学机制、早期诊断特异性标志物、药物作用靶点等开辟新的途径。

而通常疾病无论是早期诊断还是疾病发生发展过程中通常是机体分泌到血浆、血清中的低丰度蛋白质。而血浆、血清的蛋白质又有以下特点①蛋白质在组成形式上非常复杂，至少有一万种蛋白的形式，并且大多数蛋白的丰度极低②蛋白的丰度差异非常大，远超过目前分离鉴定手段所能达到的灵敏度及检测的动态范围。当然随着血浆、血清蛋白质技术的更新，比如基于质谱的蛋白质组学、基于核酸定量的蛋白质组学都给未来血浆、血清的蛋白探索提供新的可能。从如此复杂的血浆、血清的样本中寻找至关重要的生物标志物，需要解决两个问题：其一，血液样品的类型。质谱方法不能对全血进行分析，分析的样品只能是血浆或血清，而血浆和血清的形成途径不同，因而二者所含的蛋白质数量和种类会有少许的异同。HUPO PPP对正常人的蛋白血液研究表明，去血小板的EDTA血浆或枸橼酸血浆更适合血液蛋白质组学分析。基于质谱的方式检测血浆、血清蛋白质组，并没有文献支撑血浆和血清哪一个更有优势。其二：需要对样本中占主导地位且不含有新的生物信息学功能的高丰度蛋白去除

（如白蛋白、转铁球蛋白、亲血球蛋白、免疫球蛋白等），去除高丰度蛋白浓缩样品中种类繁多的低丰度蛋白便更容易检测。（高丰度蛋白去除的方法已经非常成熟详情见文献[11]- [14]，这里不再展开讨论）。

总结：

血浆血清的蛋白质组成分非常复杂，单一的基于质谱的蛋白质组学并不能鉴定其全貌。为了更好的进行血浆血清的蛋白质组研究：

1）血浆和血清的样本均可以开展基于质谱的蛋白质组学，鉴定蛋白会有少许异同，并没有文献支撑血浆样品优于血清样本

2）去血小板的EDTA血浆或枸橼酸血浆更适合血液蛋白质组学分析 

3）需要对血浆和血清去除高丰度蛋白，使得低丰度蛋白更容易被检测

二、 血浆蛋白的种类有哪些？是如何分布的？
全局把握：血浆大约含有7%的蛋白质，1%的其它物质，92%的水分。这些蛋白质包括维持机体正常生理状态的蛋白质，各种病理、生理状态下机体细胞和组织分泌、脱落的蛋白质。

血浆蛋白质总数估计在10,000种甚至更多。所含蛋白总量达到60-80mg/ml。

22种高丰度蛋白所占据血浆中总蛋白量的99%。

血浆中蛋白质浓度在一个高动态范围内(9～12个数量级)变动 即从35～50 mg/ml的血清白蛋白，到1–10 pg/ml或更低的趋化因子

主要分类：

血浆蛋白根据其来源和功能可分为：高丰度蛋白和低丰度蛋白

高丰度蛋白：

① 组成性蛋白 主要指肝脏和小肠的分泌蛋白，它们在血浆中发挥作用，如白蛋白，纤维蛋白原等。

② 免疫球蛋白 血浆中大约含有数百万种抗体

低高丰度蛋白：

①组织渗漏蛋白：组织新陈代谢或发生病理改变导致细胞损伤、死亡而进入血液的蛋白质，可用于疾病的诊断及愈后评价如心肌钙蛋白(cardiac troponins)，或心肌球蛋白(myoglobin)用于诊断心肌梗塞

②“远距离”受体和配体：肽类及蛋白质类激素，如胰岛素等生长因子；临时信使，如非激素类的蛋白

③“局部”作用的受体和配体：细胞因子及细胞反应调节因子，如IL-8

④一过性通过蛋白：如脂蛋白、溶酶体蛋白酶

⑤异常分泌蛋白：如前列腺特异性抗原（PSA）等肿瘤相关蛋白

⑥外来蛋白：如异常微生物、寄生虫、病毒的病原蛋白及其释放的蛋白

⑦小分子量的蛋白及多肽组分：主要是细胞因子、多肽类激素及较大蛋白的酶解片断

血浆中70种蛋白质种类的参考区间

1） 血浆中蛋白丰度纵坐标横跨12个数量级

2） 高峰度蛋白经典的血浆蛋白聚集在左侧（高丰度蛋白）

3） 组织渗漏蛋白(如酶和肌钙蛋白)聚集在中心

4） 细胞因子聚集在最右侧（低丰度蛋白）

289种血浆蛋白分布

统计289种血浆蛋白从相对分子质量的分布看

1）10～100 kDa的蛋白质占有相当大的比例

2）在10-100kDa的蛋白比例中：18% < 20 k Da  69% < 60 k Da 

总结：血浆的蛋白种类非常复杂，上图文献中可以看到从高丰度到低丰度从mg/ml到pg/ml。其实还有很多更低丰度的蛋白（fg/ml 飞克每毫升），基本蛋白的浓度可以从mg/ml 到ug/ml 再到pg/ml 甚至到fg/ml都有分布（浓度从大到小1000的换算单位），22种高丰度蛋白所占据血浆中总蛋白量的99%，而通常疾病发生发展过程中通常是机体分泌到血浆、血清中的低丰度蛋白质，这个给血浆的蛋白质组研究也带来了挑战。
三、血浆血清的蛋白质组学技术如何选择？

是否有一种技术可以用于血浆所有蛋白的检测呢？答案是显而易见的，需要借助多维度的手段去覆盖完整的血浆蛋白质组。

基于质谱的蛋白质组学应用的非常广泛，但是检测血浆蛋白的数目依旧有限，2002年发表的文献人血浆蛋白质组可以看出一些趋势。

 图中，有■点的〝1-D〞曲线表明在使用传统的一维鉴定血浆的蛋白能力有限，进入〝2-D〞的时代我们发现鉴定血浆蛋白种类明显有些提升，同样3+-D〞的几乎是依旧对血浆蛋白也有预见性的增加，但是鉴定蛋白数目远远达不到血浆蛋白复杂度的要求。（有▲点的曲线表明基于测序法鉴定蛋白质的能力；而250*和490⁺则表示分别使用LC/LC/2-DE和LC/LC/MS/MS所达到的鉴定蛋白质的能力。）

而从质谱的灵敏度的角度，无论是MALDI-TOF/TOF-MS 、ESI-MS/MS (ion trap)灵敏度均在0.5-1pg左右，其大部分检测蛋白的浓度在mg/ml-ug/ml的范围内，当然包含少部分ng/ml的蛋白。侧面也说明大部分的血浆的低丰度蛋白（fg/ml- ng/ml）质谱的灵敏度没办法检出。

基于核酸的蛋白质技术如PEA技术（Olink蛋白质组学），检测灵敏度可达fg/ml级别，横跨蛋白检测浓度从fg/ml-mg/ml，动态范围横跨10个log，覆盖高、中、低丰蛋白与质谱的蛋白质组学正好有很强的互补性。（PEA的技术是一种双重识别免疫分析，即两个匹配的抗体同时与一个靶标结合，并以独特的DNA寡核苷酸标记。溶液中的蛋白质使两种抗体接近，使其DNA寡核苷酸杂交，作为DNA聚合酶依赖性延伸步骤的模板，杂交和延伸后立即进行PCR扩增，最后通过微流控qPCR对扩增子进行定量）。

Olink蛋白质组学+基于质谱的蛋白质学是不是解决血浆蛋白质组最优组合手段呢？

Stefanie M. Hauck团队的在 Systems biology in cardiovascular disease: a multiomics approach文中写道：高丰度蛋白质的存在，如血清白蛋白或免疫球蛋白，在高度复杂的血浆基质中直接影响质谱检测的灵敏度，使得低丰度蛋白质如细胞因子没办法更好地被检测出来。而邻位延伸技术(Olink)相对于质谱分析增加了蛋白质组覆盖的深度。 质谱法以其灵活的动态范围和广泛的覆盖范围为优势，但是灵敏度受限。邻位延伸技术是高度标准化的，通常适用于蛋白质组的一个子集。 两种分析平台的组合 可以得出更全面的结论。 

 蛋白质组学分析的组合方法（质谱和PEA技术的互补性）同样Stefanie M. Hauck团队在2020年11月30日《Journal of Proteome Research》研究者们采用德国南部人群队列的173份人血浆样本作为目标检测样本，分别对比测试了基于质谱MS的DDA-MS、DIA-MS两种采集模式，以及PEA邻位延伸技术Olink8个Target 96 panel （C-MET、CVDII、CVDIII、ONCII、ONCIII、DEV、IMM和NEU panel）测定血浆中736个蛋白生物标志物的相对丰度。结果表明：血浆蛋白质组的高复杂度需要系统范围无偏性的技术（如mass LC−MS/MS)和高度敏感的靶向免疫分析如邻近延伸技术（PEA），队列结果显示了PEA和非靶向LC MS/MS在临床相关样本血浆蛋白鉴定和定量方面的互补性，同时研究了每种技术的潜力和局限性。

 PEA、DDA-MS和DIA-MS鉴定和定量的蛋白质数量，超过25%的样品中蛋白鉴定数目

 PEA，DDA，DIA三种技术均重叠覆盖的蛋白仅35个，占所有蛋白比例小于5%。说明这三种不同方法间有很强的互补性，通过方法学协同，可以更全面地看到血浆蛋白组的全貌

总结：

血浆血清的蛋白质组学技术如何选择？如果老师们只关注一部分的血浆的蛋白的子集（往往是低丰度的蛋白）需要借助高灵敏的PEA技术，或者进行panel search进行匹配，如果只是关注的大部分的蛋白mg/ml 到ug/ml也可以应用基于DIA、DDA的质谱技术进行血浆蛋白的检测，当然Olink蛋白质组学+基于质谱的蛋白质往往对于老师发现血浆蛋白的全貌提供了强有力的技术保障，才能挖掘更多和疾病发生发展相关的biomarker。

以上分享了血浆、血液、全血的区别，以及血浆蛋白的种类有哪些是如何分布的，最后提供了如何更准确的研究血浆蛋白质组提供了方法和文献支撑。希望对对血浆蛋白质组的老师提供一些思路。

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作者简介：

付俊 联川生物 高级产品经理

2017年加入联川生物，曾担任联川生物项目经理、生信工程师、转录调控一组组长，近3年多组学服务经验，2年售前及质谱产品开发经验，服务科用客户均口碑相传。协助用户在Nature Communications、Nature Cancer、BioMedicine、Acta Pharmaceutica Sinica B、Insect Biochem Mol Biol、Mol cell proteomics等杂志发表数十篇文章。目前负责联川生物质谱线、Olink蛋白质组学等产品的优化和更新，擅长多组学角度进行数据深入挖掘。

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