磷化工业区域农田土壤抗生素耐药的发生 | 微生物专题

期刊：Science of the Total Environment

影响因子：7.963

发表时间：2021.7

样本数：63个

研究方法：16S rRNA测序+HT-PCR

项目背景：几十年来，人类和兽用抗生素的滥用极大地促进了抗生素耐药性基因(ARGs)在世界各地的进化和传播，从而严重降低了抗生素治疗危及生命的感染时的疗效。抗生素耐药性也被确定为一个重大的公共卫生挑战。而除了抗生素的滥用导致的ARGs，金属也可以通过共同选择触发细菌对抗生素的耐药性，并且重金属对抗生素耐药性的选择压力更强、更持久。同时，病原体通过水平基因转移(HGT)从抗生素耐药细菌中获得ARG的可能性可能会增强。ARGs和金属抗性基因(MRGs)的共存在病原体基因组中比非病原体基因组中更为普遍。磷化工厂周边土壤的重金属污染一直是人们长期关注的问题；然而，在其附近的农田土壤中，抗生素抗性基因(ARGs)的发生仍未被探索。本研究主要探究磷化工业区盛行下风方向（Prevailing downwind direction）下农田表层土壤中重金属、ARGs、可移动遗传元素(MGEs)和微生物群落的变化。

实验设计：本研究采集了与磷化工工业区不同距离的农田土壤样品，并进行了化学性状、重金属和微生物群的分析。同时，利用高通量定量PCR(HT-qPCR)对384对引物分别针对几乎所有主要类别的ARGs和49个MGE标记基因进行检测，获得了样本中ARGs和MGEs的全面图谱。本研究的目的是：（1）揭示重金属污染梯度上ARG的丰度和多样性；（2）确定在工业选择压力下影响农田土壤ARG分布的主要因素。

图1 各采样点分布示意图（a）Cd含量比较（b）ARGs多样性比较

在研究区域（磷化工区）盛行风向东北向西南方向的三条线路采集表层土壤（0-20cm），分别为20m（D1）、500m（D2）、1000m（D3）、1500m（D4）、2000m（D5）、3000m（D6）、4000m（D7）（图1a）。在每个地点，建立了3个10×10平方米的地块，间隔距离约为10米。在每个样方中，随机抽取3个土壤样品，并合并成一个复合样品(图1a)。

主要结果：
01 土壤化学性质和重金属浓度

通过测定不同采样点土壤表层（0-20cm)的土壤理化性质和重金属污染特性，发现D1和D2区域的Cd含量明显高于D3-D7区域（ >1000 m），见图1b，不同采样点土壤中TN、TOC和7种主要元素含量无显著差异，但D1处相比起其他采样点含有更低的Al含量和更高的Mg含量。另外，与D3-D5的采样点相比，D1采样点的pH明显更高。

02 土壤ARGs和MGEs丰度和多样性变化

在所有的土壤样品中，共检测到149个ARG和28个MGEs。沿采样线的土壤样品中ARGs多样性无显著性差异（图1c）。土壤中总ARGs的相对丰度随着距离的增加(在1000m范围内)急剧下降，然后随距离的增加略有增加(图2a)。基于Bray-Curtis距离的PCoA分析显示(图2b），D1处的土壤样本聚集在一起，并沿着PC1和PC2与其他样品(Adonis检验，P=0.004)明显分离，分别解释了51.69%和26.36%的方差。而在距离工业区>500m(D2-D7)处采集的土壤样品之间没有明显的分离。土壤样品中MGEs的检测数量和相对丰度随距离无显著变化。MGEs的PCoA分析显示，D1处的土壤样品与其他土壤样品存在明显差异，与ARGs的分布模式相似。

 图2 不同距离土壤样品中ARGs的相对丰度和PCoA分析

03土壤细菌组成特点

以16SrRNA基因的绝对拷贝数表示细菌丰度，从1.85×10⁹到1.29×10¹⁰拷贝g⁻¹不等。在500m以上(D2-D7)处采集的土壤样品的细菌丰度显著高于D1处。

从16SrRNA测序结果可知，细菌多样性在 observed species、Shannon、和Invsimpson指数方面无显著差异。PCoA分析（图3a）显示，距离工业区500m以上的土壤样品细菌群落结构无显著差异，与D1采集的土壤样品有明显分离，Adonis检验结果表明(P=0.001)，这一结果与前面的ARGs和MGEs的分布趋势一致。在门水平上，土壤样品间的细菌群落组成相似（图3b），主要的优势物种为放线菌门、变形菌门、氯菌门和酸菌门。

图3 细菌群落PCoA分析和菌群丰度柱状堆叠图

04土壤生物和非生物因素对抗生素耐药性的影响

研究区所有采样点土壤Cd含量均超过农田土壤污染风险控制标准。本研究重点评价了镉对土壤ARGs的影响。Mantel test分析结果表明，Cd含量与ARGs丰度和组成、土壤pH和四种MGEs都具有显著的相关性。同时，变形菌门、放线菌门和拟杆菌门与ARGs的组成有关。通过VPA分析研究Cd、MGEs和细菌群落对ARG分布的影响，结果表明，土壤Cd（15.90%）和MGEs（20.25%）对总方差的贡献相似，但两者均远高于细菌群落（2.12%）。此外， Procrustes分析(M2=0.725，P=0.008)和Mantel test分析(r=0.364，P=0.002)表明，ARGs与细菌群落结构存在显著但较弱的相关性。

 图4 Mantel test分析和VPA分析

小贴士：在群落分析中，为了探索群落物种组成是否与环境相关，经常会使用到Mantel test分析。那什么是Mantel test分析呢？Mantel test是确定两组距离矩阵（而非两组变量矩阵）之间相关性的分析方法，用于判断一个矩阵中的样本距离与另一矩阵中的样本距离是否相关。想进行分析又不会代码怎么办？别慌，小编为您提供一款非常好用的云工具-联川生物云工具-相关性分析（https://www.omicstudio.cn/tool/62），详细操作指南在Mantel Test：菌群与环境因子相关性分析 | 云平台（https://mp.weixin.qq.com/s/nO7RXqz7XluGTwNeyn4pdg）一文中有详细介绍，赶快去试试吧！

结构方程模型揭示了多种驱动因子对土壤ARGs有直接和间接影响。ARGs相对丰度的88%的方差可以用该模型来解释。Cd含量的变化对ARG丰度(λ=0.472，P<0.001)有显著的正向直接影响，并可通过改变土壤MGEs(λ=0.625，P<0.05)和细菌群落组成(λ=−0.608，P<0.001)间接影响ARG的丰度。MGEs的丰度与ARGs呈较强的正相关关系(λ=0.617，P<0.001)，MGEs对ARG丰度的标准化总效应与土壤Cd含量大致相同（图5）。细菌群落组成是通过对MGEs的影响间接对ARGs产生较强间接影响的(λ=0.616，P<0.05)，而其直接影响可以忽略不计。

 图5 结构方程模型(SEM)显示了影响ARGs相对丰度的生物和非生物因素。

重要结论：研究对受磷化学生产影响的农田镉污染土壤中ARGs的丰度和组成进行了全面的研究。结果表明，Cd胁迫显著提高了ARGs的丰度和质粒介导的结合转移潜能。土壤Cd和MGEs被认为是驱动ARGs变化的主要因素，前者通过改变MGE丰度和微生物组成对ARGs产生影响。综上所述，有必要对受长期磷化学品生产活动影响的农田土壤ARG污染进行生态和健康风险评估，化学污染和抗生素耐受之间可能存在着我们意想不到的联系。

编者语：本研究在土壤生物因素和非生物因素对ARGs影响方面的研究采用了很多比较经典的方法，比如，Mantel test 、RDA、VPA、结构方程和Procrustes分析等，分析方法全面，结果一致性和可信度高。如果有相似研究目的的老师，如果不清楚环境指标与菌群之间的相关性怎么研究，这些分析方法都是不错的选择！

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