灰叶枯病茶树根际分泌物招募微生物以抵御病原体侵染 | 微生物专题

发表时间：2021.12.1

发表期刊：Front. Microbiol.（IF 5.640）

研究对象：茶树根际菌

研究方法：16S rRNA基因测序、ITS、LC-MS/MS

研究背景

茶灰霉病及其现有防治措施阻碍了茶园的可持续发展，目前还没有非常有效的生物控制措施。因此研究茶树根际有益微生物群落对防治茶树灰枯病具有重要意义。在本研究中通过在茶树幼苗叶片上接种茶疫霉来制备处理后土壤。结果表明，在处理土壤中生长的茶树幼苗具有较低的病害指数和较高的生长活力。土壤微生物群落分析表明，受茶花菌侵染后，根际真菌和细菌群落发生了改变。属级分析表明，在处理土壤中，真菌木霉、青霉和胶质瓢虫以及细菌假单胞菌、链霉菌、芽孢杆菌和伯克霍尔德菌的丰度显著增加。通过分离、培养和接种试验，作者发现诱导菌属中的大多数菌株都能抑制茶灰枯病菌的侵染，促进茶树幼苗生长。

研究设计

作者检测了在处理土壤和对照土壤中生长的新鲜茶树幼苗的生长特征以及抗病性能。再使用16S rRNA基因测序与ITS测序对24个病原菌侵染的茶树幼苗根际微生物群落进行分析、LC-MS/MS评估根系分泌物。

主要结果

1. 茶灰霉病病原菌

从表现出典型茶灰枯病症状的茶叶中分离出10株真菌，其中4个菌株对茶叶有明显的致病性。根据菌落形态、分生孢子特征以及ITS、β-微管蛋白和TEF序列，这四个菌株被鉴定为茶花菌。当鉴定出的菌株重新接种到茶叶上时，7天后，它们在茶叶上产生了典型的茶灰色枯萎病斑点。

图1 茶树灰枯病病原鉴定及致病性试验

结果表明，在处理土壤中生长的茶树幼苗的DI显著低于在对照土壤中生长的茶树幼苗。在没有茶树幼苗的情况下，在处理土壤中生长的茶树幼苗比在对照土壤中生长的茶树幼苗生长状态更佳。这表明，处理土壤能促进茶树幼苗的生长。此外，在处理土壤和对照土壤之间pH值和养分含量（NH4+、NO3）没有显著差异。这些数据表明土壤中养分并不是致使茶树幼苗生长状态不同的主要因素。

图2 处理土壤、对照土壤中生长的茶树幼苗的疾病指数

2. 植物被病原菌侵染后对土壤真菌和细菌群落的影响

通过PacBio测序分析了处理土壤和对照土壤的根际和体积土壤。共获得17877个真菌OTU和18179个细菌OTU，分别用于真菌和细菌群落的分析。基于Bray-Curtis统计的PCoA结果表明，根际土壤中真菌和细菌的群落结构与散装土壤中的显著不同。处理土壤和对照土壤之间的微生物群落差异较小，而处理土壤和对照根际土壤之间的差异较大。在处理土壤和对照土壤之间，真菌的丰度和多样性没有显示出显著差异。与对照土壤相比，处理土壤中的细菌丰度显著降低，而细菌多样性没有显示出显著差异。

图3 处理土壤和对照土壤中真菌（A）和细菌（B）的主坐标分析（PCoA），真菌（C，E）和细菌（D，F）的群落丰度和多样性指数。

3. 处理土壤的微生物组成

在属水平上，12个真菌属在对照和条件根际土壤之间表现出显著差异。与对照根际土壤相比，植物被感染的根际土壤中有两个菌属的相对丰度显著增加，两个属的相对丰度显著降低。其中，木霉、青霉和胶质瓢虫病在条件根际土壤中富集，而被孢霉是促进土壤养分转化的重要真菌，受到地上病原菌感染的抑制。至于土壤真菌，在15个属中有3个表现出显著的变化；在处理土壤中，9个属的相对丰度显著降低，而6个属的相对丰度显著增加。地上病原菌侵染对土壤有益和有害真菌的影响不显著。至于根际细菌，16个细菌属在对照土壤和处理土壤之间表现出显著差异。七个属的相对丰度显著增加，而九个属的相对丰度因地上病原体感染而减少。在这些属中，与植物生长相关的黄细菌和根瘤菌受到抑制。然而，链霉菌、芽孢杆菌、伯克霍尔德菌和假单胞菌在条件根际土壤中显著增加。

图4 在属水平上比较条件根际土壤和对照根际土壤的真菌（A）和细菌（B）丰度差异

4. 地上病原菌侵染对茶树幼苗根系分泌物的影响

通过UPLC-MS/MS检测健康和感染茶树幼苗的根系分泌物。在所有样本中，共鉴定出544种化合物，根据其化学性质可分为九大类：脂类、酚酸、有机酸、氨基酸和衍生物、类黄酮、核苷酸和衍生物，生物碱、萜类和其他。从火山图可以看出，两种处理之间198种化合物的表达存在显著差异。与对照组相比，病原体感染组20种代谢物的表达显著上调，178种代谢物的表达显著下调。在化合物水平上评估时，198种显著改变的代谢物包括脂质、酚酸、有机酸、氨基酸和衍生物、类黄酮、细胞核和衍生物、生物碱和其他。当在组水平上进行评估时，发现对照幼苗中的氨基酸和衍生物、有机酸和生物碱显著较高（p<0.05），而接种病原菌的幼苗中的酚酸和黄酮显著较高。茶树孢子虫感染导致酚酸和类黄酮的分泌显著增加，而氨基酸和衍生物、有机酸和生物碱的分泌减少。

图5 A）两种处理之间代谢物差异表达的火山图 B）对照处理和接种病原菌的茶树幼苗根系分泌物中显著差异物质的热图 C）化合物类别的累积峰面积

5. 分泌物对疾病的抑制作用

根尖分泌物的抗病效果表明，用PI泥浆处理的茶树幼苗的DI显著低于用PR、NS或WC泥浆处理的茶树幼苗。重要的是，过滤去除微生物的土壤泥浆对DI没有显著影响，这表明茶树幼苗中的ISR（诱导性全身抵抗）是微生物，而不是分泌物。为了评估诱导ISR所需的微生物组数量，将PI浆料以90%、50%和10%w/w的比例混合到PR浆料中。结果表明，90%和50%的PI微生物组至少可以部分抑制该疾病。

图6 在不同土壤条件上生长的茶树幼苗的疾病指数

6. 有益微生物对茶树幼苗的生长促进和抗病性诱导

从条件根际土壤中分离筛选出9株有益菌株。三株为真菌、六株为细菌。对抗培养的结果显示，所有分离物都对茶花疫霉具有抗原活性。对9个菌株进行了ISR诱导茶树幼苗的试验。所有九种有益微生物都能降低茶树幼苗的DI，其中Z7和X5的效果最为明显。生长试验结果表明，除X5和X14外，所有微生物均能显著促进茶树幼苗的生长，其中Z45和X45的作用最为明显。

图7 有益真菌和细菌对茶树幼苗生长和茶灰霉病的影响

主要结论

茶树在地上部分被感染后根系分泌物如酚酸和黄酮类化合物的分泌增加，从而使得根际微生物组成发生变化。这些变化赋予茶树幼苗对后续感染具有一定抗性。向土壤中添加酚酸和黄酮类化合物的混合物导致了类似于地上病原体感染引起的反应。实验结果说明茶灰枯病霉感染可以改变茶树幼苗的根系分泌物，将有益微生物引入根际，诱导植物产生系统性抗病性。

参考文献：

Wang Q, Yang R, Peng W, et al. Tea Plants With Gray Blight Have Altered Root Exudates That Recruit a Beneficial Rhizosphere Microbiome to Prime Immunity Against Aboveground Pathogen Infection. Front Microbiol. 2021;12:774438. Published 2021 Dec 1.

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