几类经典场景下的单细胞分析套路，赶紧来围观！（文末有彩蛋）| 单细胞专题
不同于常规组学，单细胞测序的数据可挖掘的方向非常多，对于分析运算的服务器配置要求也非常高。
一篇好的单细胞文章，需要经过N多次的数据处理和分析挖掘，才能将符合研究逻辑的数据和图片展示在文章中。
有经验的生信工程师会在相对较短的时间内，拿到有用的信息，安排合理的数据分析流程，在N-m（m代表经验值）次的数据挖掘后，得到一套可用于文章中单细胞数据和图片。
因此，对于初学的研究者来说，明了一套单细胞分析套路，吸收经验以最大程度减少分析时间成本，是非常有必要的。
笔者在以下展示了皮肤与衰老、精子与发育、癌症与转移、心肌梗死与治疗为主题的4类研究场景下的单细胞分析套路：
皮肤与衰老主题
1) 背景介绍
皮肤衰老是人体衰老最显著的外在特征，表现为表皮层和真皮层间空隙增大、缺乏张力、松弛、愈伤功能衰退等，此外皮肤衰老还会导致皮肤屏障和防御功能的降低、皮肤衰老相关疾病发病率升高。目前人们对于皮肤衰老的机制提出了许多学说，如衰老基因学说、自由基学说、线粒体学说、神经内分泌学说及细胞凋亡学说、端粒学说等理论，从有机整体到细胞及分子水平等不同角度来认识衰老的问题具有重要意义。
2）样本采集
考虑到皮肤衰老涉及的因素众多，我们在这里以年龄作为变量来探究，那么收集样本时，需要注意选取性别相同、遗传背景、生活方式、身体状况等相近的不同年龄段人的相同部位的皮肤组织：如新生儿（0岁）、青年（18岁）、中年（35岁）、老年（60岁）四个时间点，建议每组样本不少于3个。
3）分析内容
分析流程图
Fig1. 皮肤衰老的形态学变化
宏观以及微观角度描述皮肤衰老的形态学变化，包括表皮厚度、表皮真皮占比以及真皮胶原密度等等。
Fig2. 细胞分群与细胞类型鉴定
首先需要对所有样本的细胞进行聚类分群，然后根据各cluster的marker基因表达情况对其进行鉴定。人皮肤细胞类型参考：上皮细胞（基底细胞、有棘细胞、颗粒细胞、角质层细胞、皮脂腺、毫毛毛囊）、黑色素细胞、免疫细胞（CD4、CD8、Treg、树突状细胞、肥大细胞、巨噬细胞），内皮细胞，间充质细胞，神经嵴细胞（成纤维细胞、周皮细胞）。以下为示例图：
Fig3. 关键细胞类型在不同年龄段的差异分析
①统计每组样本的细胞成分，观察年龄对于皮肤组织细胞类型组成的影响。以下为示例图：
②根据上面得出组分上有差别的细胞类群进行差异分析。可以以新生儿组作为对照，其他三个年龄段作为实验组，依次将三个实验组的不同细胞类型与新生儿组进行比较，得到多组差异基因集，然后进行GO/KEGG富集分析，更加直观地看到同一种细胞类型在不同年龄点时的生物学特点。在这一部分，还可以取三个实验组差异基因的交集，寻找与衰老相关通路联系最紧密的细胞类型。以下为示例图：
③或者根据以往文献中报道的跟衰老相关的细胞类群，进行差异分析（比如参考文献：真皮中成纤维细胞与皮肤衰老密切相关，表皮细胞通过基底细胞不断分化产生而维持其稳态，因此我们假设成纤维细胞和基底细胞对皮肤衰老起着至关重要的作用）。
通过（儿童、青年、中年基底细胞）vs（老年基底细胞）以及（儿童、青年、中年成纤维细胞）vs（老年成纤维细胞）两个比较组研究皮肤衰老伴随的细胞类型变化与哪些基因或者通路相关。
关注差异基因及其富集通路，再将重点关注的通路（如光老化相关途径）的基因在4组样品不同细胞类型中的表达情况以热图形式呈现出来，观察通路上的基因随着年龄增加呈现的表达模式，以及在不同细胞类型中是否有表达水平差异。
Fig4. 拟时序分析
针对上述与衰老联系紧密的细胞类型，可以进行拟时序分析，探究该种细胞是否会随年龄的增长而发生定向改变。并对分化节点的一些调控细胞变化的关键基因再通过GO/KEGG添加功能注释寻找相关通路。
Fig5. 细胞互作分析，探究免疫细胞是否参与调控
研究表明，调节性T细胞对毛发代谢具有刺激作用，通过cellphoneDB/cellcall等件分析细胞间的互作关系，探究免疫细胞是否通过配体受体对与基底细胞/成纤维细胞互作，促使其耗竭，调控皮肤细胞衰老进程。并得到与关键细胞互作紧密的其他细胞类型，这些细胞很可能是间接调控衰老发生的重要细胞类型。以下为示例图：
Fig6. WGCNA分析
单细胞转录组数据可以进行不同细胞类型的WGCNA分析，挖掘出与基底细胞成纤维细胞相关性大的基因模块。做GO和KEGG富集分析，研究关键通路。提取相关模块基因的在不同样品中的表达量，做趋势分析，挖掘出基因表达水平随年龄增加而增加或者减少的基因。以下为示例图：
Fig7. 功能验证
通过免疫荧光、免疫组化或者细胞功能实验等对前面找到的关键基因或通路进行验证。紫外辐射可以加速皮肤衰老，观察目的基因在紫外辐射处理前后的表达水平；进一步地，构建目的基因的过表达和敲除小鼠模型观察皮肤衰老情况以及基底细胞成纤维细胞耗竭情况等等都是后续验证实验中可采取的方式
4）结语
利用单细胞测序技术和一些常见的分析方法，可以比较清晰地发现各个细胞类型在整个皮肤衰老过程中的变化。如果顺利的话，能够找到直接导致皮肤衰老的关键细胞类型和调控通路，并确定包括免疫细胞在内的具有间接调控作用的其他细胞类型发挥作用。当然，进一步的验证也是十分必要的。
参考文献
1. Zou Z, et al. A Single-Cell Transcriptomic Atlas of Human Skin Aging. Dev Cell. 2021 Feb 8;56(3):383-397.e8.
2.Yu Y, et al. A stress-induced miR-31–CLOCK–ERK pathway is a key driver and therapeutic target for skin aging. Nat Aging. 2021 Aug 16;1(9):795–809.
3. Ge Y, et al. The aging skin microenvironment dictates stem cell behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Mar 10;117(10):5339-5350.
4. Ali N, et al. Regulatory T Cells in Skin Facilitate Epithelial Stem Cell Differentiation. Cell. 2017 Jun 1;169(6):1119-1129.e11.
02
精子与发育主题
1）研究背景
精子发生产生成熟的雄性配子对于动物世代之间遗传信息的正确传递和繁衍生息至关重要。精原干细胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）的维持、分化以及随后精母细胞的减数分裂是精子发生的关键事件。
过去的分子生物学及转录组研究虽然从不同程度揭示了性成熟前后小鼠睾丸精子发生过程中的转录特征，但对性成熟前后小鼠精子发生过程中的单细胞图谱及其机制的研究甚少，单细胞转录组测序技术的出现对于揭示睾丸的单细胞图谱及其功能机制提供了特别好的研究手段。
基于单细胞测序技术可以探究小鼠睾丸精子发生和发育机制，涉及到一系列分析结果。
2）研究内容
通过对不同年龄阶段的小鼠，取睾丸组织进行单细胞测序，研究精子发育的进程和细胞类型变化，以及发育相关基因的表达变化，揭示精子发育的机制。
a. 组织学分析
通过组织切片，分析不同年龄阶段的睾丸形态学，精细胞形态、分布等情况，从宏观角度展示差异。以下为示例图：
b. 单细胞数据中的细胞鉴定和marker可视化
通过细胞marker映射到cluster，得到细胞鉴定结果，并对marker在已经鉴定的细胞中进行可视化比较。以下为示例图：
c. 不同发育阶段生精细胞/精子的基因表达和功能差异
性成熟前后各种生精细胞及睾丸精子间差异分析，从细胞分子层面揭示小鼠性成熟前后生精能力及各种生精细胞的变化。以下为示例图：
d. 细胞周期分析
对性成熟前后小鼠睾丸精原细胞进行细胞周期分析，精原细胞的有丝分裂强弱决定着睾丸的生精能力，细胞周期分析中，会将精原细胞分成G1期，G2M期和S期三大类，如果G1期细胞占比较高，说明细胞分裂能力较弱，即睾丸生精能力弱，如果G2M期和S期占比较高说明细胞分裂能力较强，即睾丸生精能力强。
e. 拟时序分析
对性成熟前后小鼠睾丸细胞进行拟时序分析，揭示睾丸不同生精细胞在不同时期的分化轨迹。
参考文献
1.Wang M, et al. Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis. Cell Stem Cell. 2018 Oct 4;23(4):599-614.e4.
2.Jung M, et al. Unified single-cell analysis of testis gene regulation and pathology in five mouse strains. Elife. 2019 Jun 25;8:e43966.
癌症与转移主题
1.研究背景
癌症是目前致死率最高的几类疾病之一，大部分癌症在患病晚期会伴随着转移的现象，癌细胞转移是致死率增高的主要原因。
目前像肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肠癌等癌症的研究已经非常广泛，通过细胞水平和分子水平研究癌症发病原因、预后和转移机制是临床上亟待需求解决的问题，单细胞测序是非常契合的检测和分析手段。
单细胞测序拿到数据以后可以从哪些方面入手分析呢？
1）全套数据图谱
首先是要进行细胞鉴定，目前细胞鉴定最常见的手段就是结合数据库注释（例如：singleR、cellmarker等）和人工选择marker基因（一般是从文献中筛选已经验证过的marker）对细胞分群的cluster进行鉴定，最后确定细胞类型。研究癌症/转灶比较关注的细胞类型包括：实质细胞、上皮细胞、血管内皮细胞以及免疫细胞等，以下是一些常见的可视化结果：
2）重点细胞的锁定
鉴定完细胞类型后，接下来就是要锁定目标细胞类群了，可以通过细胞组分（比率）组间的差异（癌/癌旁，原发灶/转移灶）去确定，也可以通过一些已知的背景知识去假设，比如肝癌靶向治疗基本上都是酪氨酸激酶相关的，那么初步的研究重点也可以放在靶向药物所指向的细胞类型中，比如内皮细胞，上皮细胞等，重点关注酪氨酸激酶通路/转录因子的分子变化。
3）细胞功能的研究
比较以上锁定的细胞在原发病灶和转移病灶中的差异，除了分析细胞内基因表达的差异，也可以采用最常见的GO和KEGG富集分析，还可以进行GSEA、GSVA、SCENIC等分析，从功能、通路、基因调控网络等方面进行探究。
4）细胞演化/细胞互作分析
通过拟时序分析还原细胞分化的轨迹，既可以探究非癌细胞向癌细胞/或者免疫细胞的分化情况，也可以比较原发灶/转移灶中分化情况的差异。
在锁定目标细胞类群之后，还可以通过受体-配体分析，找到与目标细胞相互作用的其他细胞类型，找到“直接”和“间接”的细胞调控网络。当然，对于已经筛选出目标基因了，也可以通过PPI分析找到基因/蛋白间的互作关系。
5）免疫细胞的变化
肿瘤的恶性程度研究肯定绕不开免疫细胞，一般肿瘤组织内或者附近的免疫细胞较正常的组织会更丰富，但是肿瘤细胞又可能会有一些类群，表达特定gene，进行免疫逃逸，甚至可能会出现肿瘤组织中T细胞耗竭的现象，这些都是正常细胞与肿瘤细胞抗争之后的结果。为了将肿瘤中免疫反应描绘出来，可以参考以下分析：如免疫细胞再分群，得到更多功能更加精细化的免疫细胞亚群；免疫细胞类群的分布变化（基于分组）；免疫细胞类群的拟时序分析等，探究不同恶性程度下的免疫反应机制。
6）CNV分析
在原发病灶和转移病灶的比较中，癌细胞可能会存在异质性，除了上面的差异分析以外，还可以通过染色体拷贝数变异分析（inferCNV）探究不同部位的癌细胞在染色体拷贝上是否存在差异，表征癌细胞的起源和演化后的异质性问题，这个分析还可以用来佐证癌细胞鉴定的结果。
7）湿实验
除了以上单细胞测序数据相关分析以外，补充验证性的湿实验也是有必要的。流式、免疫组化、病理切片、SMART-seq/SMART-qPCR对目标基因的定量等实验，可根据实验安排进行补，以完善整体文章设计。
参考文献：
1. Laughney AM, et al. Regenerative lineages and immune-mediated pruning in lung cancer metastasis. Nat Med. 2020 Feb;26(2):259-269.
2. Kim N, et al. Single-cell RNA sequencing demonstrates the molecular and cellular reprogramming of metastatic lung adenocarcinoma. Nat Commun. 2020 May 8;11(1):2285.
3. He D, et al. Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneous tumor and immune cell populations in early-stage lung adenocarcinomas harboring EGFR mutations. Oncogene. 2021 Jan;40(2):355-368.
4. Lu T, et al. Single-cell transcriptome atlas of lung adenocarcinoma featured with ground glass nodules. Cell Discov. 2020 Oct 6;6:69.
心肌梗死与治疗主题
1）研究背景
心肌梗死是一种缺血性心脏病，缺血区心肌细胞会以每小时20%的速度死亡。在心肌梗死过程中，受损的心肌细胞或免疫细胞会通过细胞因子等将白细胞募集到损伤部位，比如中性粒细胞，它们不仅负责清除死细胞和基质碎片，还负责产生细胞毒性和炎症因子。随后白细胞募集和激活导致梗死组织中出现炎症。因此，抗炎治疗可能有助于控制心肌梗死期间的组织损伤。单细胞测序技术对于探究心肌梗死过程和药物治疗涉及到的细胞相应和分子变化具有较好的应用潜力。
2）实验设计和样本信息
正常对照组、心肌梗死组和用药物治疗后心肌梗死得到缓解组的大鼠，样本生物学重复每组3个或以上。
3）数据分析总览
a. 大类细胞图谱的展示，细胞比例的差异比较等，形式多样：
l 文章总体技术路线展示
l tsne/umap（按分组、按细胞类型、按cluster）
l marker基因鉴定点图、热图、小提琴图、tsne/umap图
l 细胞比例差异比较柱状图→ 引出下一部分需要讨论的细胞群体
b. 细胞亚群特征分析
假设通过上一步的研究发现心肌细胞与免疫细胞在不同分组存在显著差异，针对这部分细胞单 独进行亚分群展示不同细胞类型的特征。
l 主要展示亚群的分布，比较不同分组差异基因的功能富集结果（经典富集分析、GSEA、GSVA），来找到参与缓解心肌梗死相关功能通路的主要细胞类型
l 基于拟时序分析来确认心肌细胞心肌梗死向缓解过程中的基因表达变化以及细胞类型转化等
l 通过SCENIC分析来确认参与抗炎以及招募免疫细胞相关的细胞因子
c. 细胞间通讯分析
对心肌细胞与免疫细胞进行细胞互作分析确认参与心肌梗死的主要配受体信息，找到重点关注的基因表达调控关系。细胞间通讯能在基因互作、转录因子调控、功能通路富集等多方面展示信息，可以作为主要深入分析的内容。展现形式有点图、热图、网络图等。
d. 研究假设
猜想：用药物治疗后心肌梗死得到缓解的大鼠可能含有更多的心肌细胞；得到缓解的大鼠体内的免疫反应可能会逐渐趋向平稳，免疫细胞数量变少。心肌细胞：心肌梗死能造成心脏大面积心肌缺血，导致心肌细胞逐渐坏死减少，收缩相关的基因的表达水平会逐渐下降；比较心肌细胞再分群后的两组间差异，可以先从cluster占比入手，主要关注前后占比差异大的cluster；根据不同分组间的上下调基因判断可能的关键基因（隐形靶点）。
免疫细胞：为吞噬坏死的心肌细胞，巨噬细胞的数量会变多，吞噬功能会更加活跃（M1型的巨噬细胞会分泌促炎因子），在心肌梗死得到缓解后，M1型巨噬细胞会逐渐向M2型分化（这块可加轨迹分析），M2型巨噬细胞会分泌抗炎因子，主要起到至于缓和的作用；巨噬细胞的增多，会激活T细胞，从而引起一系列免疫反应。这块可以分组做一下巨噬细胞和淋巴细胞的细胞互作分析，看一下区别。
e. IHC实验验证靶点效果
通过IHC实验对找到的关键作用基因进行验证，确认心肌梗死细胞在阻断/激活某通路或抑制/促进某基因表达来达到心梗死区域的减少以及恢复。
参考文献
1. Ruiz-Villalba A, et al. Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals a Crucial Role for CTHRC1 (Collagen Triple Helix Repeat Containing 1) Cardiac Fibroblasts After Myocardial Infarction. Circulation. 2020 Nov 10;142(19):1831-1847.
2. de Soysa TY, et al. Single-cell analysis of cardiogenesis reveals basis for organ-level developmental defects. Nature. 2019 Aug;572(7767):120-124.
3. Wang Y, et al. Single-cell analysis of murine fibroblasts identifies neonatal to adult switching that regulates cardiomyocyte maturation. Nat Commun. 2020 May 22;11(1):2585.
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