应用系列之：5-10分单细胞研究是怎么做的？|单细胞专题
对于广大科研学者来说，首次开展单细胞研究往往是无从下手的境地，如果能有一套可以参考的模板，明了其他已发表的文章的架构信息，对于自己的课题设计将会是非常有帮助的！联川近期将集中推出单细胞应用系列，以杂志影响因子（IF）为衡量标准，对不同IF的杂志的单细胞文章进行归类和整理，解析了不同层次的单细胞研究是如何开展的。
笔者在未来一周将分别以5-10分、10-20分、20分+的一些研究案例为对象，展示实验设计、样本信息、研究方法、研究内容、研究结果和文章评价等信息，帮助读者全面了解单细胞研究是怎么做的！
本期整理的5-10分单细胞研究，有经典的细胞功能研究（如干细胞，基质细胞等），新细胞类群的发现，标志物研究，肿瘤进展研究，肿瘤免疫和能量代谢研究，以及非模式生物的单细胞研究等方面，下面读者们一起来围观5-10分单细胞研究是怎么做的？
一、通过CRISPR-Cas9报告基因鉴定细胞表面标记物，从人类iPSC中分离软骨祖细胞
发表期刊：Stem Cell Research & Therapy
影响因子：6.833
发表时间：2020.2
研究内容：通过表面标记筛选识别新的软骨祖细胞群，使用单细胞RNA测序研究细胞群体特征及基因表达谱，评估未分选和分选的软骨祖细胞的软骨形成能力。
样本类型：RVR COL2A1-GFP敲入细胞系和BJFF细胞系
样本数量：分选和未分选的细胞
研究方法：scRNA-seq
实验设计：见下图
本文使用 CRISPR-Cas9编辑的COL2A1-GFP敲入报告基因hiPSC细胞系，结合表面标记筛选来识别新的软骨祖细胞群。然后使用单细胞RNA测序研究该群体的基因表达谱并识别其中的子集。测量基质产生、细胞形态和基因表达以评估未分选和分选的软骨祖细胞的软骨形成能力。
研究结果：
1.使用COL2A1-GFP报告系，确定了表面标记的新组合（即PDGFRβ + /CD146 + /CD166 + /CD45 -) ，描绘了一个独特的祖细胞群，在 hiPSC软骨形成中具有强大的软骨形成潜力。
2. 未分选的软骨祖细胞中鉴定到9个细胞簇，3个细胞群表现出几种间充质标记物的高表达水平，包括PRRX1、COL1A1、COL5A1和COL6A1。
3.分选软骨细胞的scRNA-seq结果显示，至少有6个细胞群由PDGFRβ + /CD146 + /CD166 +细胞组成。分选的细胞有更稳健和同质的基质产生，同时有著更高的软骨基因表达（即SOX9、COL2A1、ACAN；p<0.05）。
4. 生化分析表明，来自分选的软骨祖细胞的软骨颗粒显示出软骨基质产生和基因表达的显着增加，同时消除了周围的非软骨细胞样细胞层。
文章评价：本文使用CRISPR-Cas9编辑的COL2A1-GFP敲入报告基因hiPSC系，结合表面标记筛选，定义了软骨细胞群的细胞表面标志物。同时分析了分选前和分选后细胞群体的特征及基因表达情况。验证说明了用表面标记可从人类hiPSC中分选具有很强软骨形成潜力的祖细胞，而无需进行基因修饰以改善hiPSC软骨形成，有助于未来的软骨组织工程和疾病建模研究，以提高对OA等关节疾病的理解和治疗。
参考文献：
Dicks A, et al. Prospective isolation of chondroprogenitors from human iPSCs based on cell surface markers identified using a CRISPR-Cas9-generated reporter. Stem Cell Res Ther. 2020 Feb 18;11(1):66.
二、单细胞测序显示体外培养的人原代沃顿凝胶间充质干细胞/基质细胞的异质性
发表期刊：Stem Cell Research & Therapy
影响因子：6.833
发表时间：2020.4
研究内容：单细胞测序发现在间充质干细胞群中发现的基因高可变区与经典的间充质干细胞功能相关，可能被用作进一步关联研究的候选标记。
样本数量：3个
样本类型：供者体外培养的人原代Wharton’s jelly间充质干细胞
实验方法：单细胞转录组测序
实验设计：见下图
作者通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)研究了三个供者体外培养的人原代Wharton’s jelly间充质干细胞(WJMSCs)的基因表达谱。还基于scRNA-seq数据分离了CD142+和CD142 WJMSCs，并比较了它们在体外的增殖能力和“伤口愈合”能力。同时，作者分析了公开可用的脂肪来源间充质干细胞(ADMSCs)scrna-seq数据，并在单细胞水平上对WJMSCS和ADMSCS进行了转录组比较。
研究结果：作者从WJMSCs中获得的高可变区基因(HVGs)的GO富集分析显示，这些基因在胞外区显著富集，具有结合功能，参与发育过程、信号转导、细胞增殖等。通路分析表明，这些HVGs与经典MSCs的功能特性有关，如由趋化因子和细胞因子信号介导的炎症、整合素信号和血管生成。这些HVG被用于降维和聚类分析中亚群鉴定的主要候选marker。差异表达的基因分析显示，存在几个不同的MSCs亚群，它们表现出与增殖、发育和炎症反应相关的不同功能特征。与作者的数据一致，分选的CD142+和CD142−骨髓间充质干细胞显示出明显的增殖能力和“伤口愈合”潜能。尽管WJMSCs和ADMSCs来源于不同的组织，表现出不同的分化潜能，但它们的HVG在很大程度上是重叠的，具有相似的功能富集。
文章评价：这篇文章通过单细胞转录组测序分析了WJMSCs细胞的高可变区基因，随后与公开可用的ADMSCs单细胞测序数据作对比，发现其中的高可变基因HVG可用于发育盒炎症的候选标记。单细胞数据+公共数据+细胞实验的综合论证，文章逻辑结构严谨。
参考文献
Sun C, et al. Single-cell RNA-seq highlights heterogeneity in human primary Wharton's jelly mesenchymal stem/stromal cells cultured in vitro. Stem Cell Res Ther. 2020 Apr 6;11(1):149.
三、单细胞分析揭示肿瘤淋巴结中的免疫调节和代谢转换
发表期刊：Oncoimmunology
影响因子：8.113
发表时间：2020.09
研究内容：通过单细胞转录组测序揭示乳腺癌进展过程中肿瘤淋巴结（TDLN）的重编程及其发生机制
样本类型：小鼠腋窝和腹股沟淋巴结
样本数量：FVB/NJ（正常小鼠）和MMTV-PyMT小鼠（荷瘤小鼠）（11周龄）各一只
研究方法：scRNA-seq
实验设计：见下图
为了模拟自然发生的乳腺肿瘤发生，本文使用MMTV-PyMT小鼠作为研究模型，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究了TDLN中免疫细胞和FRC的转录组，以解决这些细胞中表达谱的变化，通过生物信息学分析确定了其改变的途径。研究结果为乳腺癌细胞如何影响免疫细胞群以及在乳腺癌早期转移阶段重新编程TDLN中FRC的代谢提供了新的见解。
研究结果：
1. 利用经典的免疫表型标记，本文初步鉴定了T细胞、细胞毒性T细胞、衰竭T细胞、调节性T细胞（Tregs）、幼稚T细胞、B细胞和成纤维细胞（FRCs）7个细胞类型。
2. 根据免疫学特征和通路分析，CD4+和 CD8+T细胞的显示出血管生成通路相关基因上调和更高的调节性T (Treg) 相关基因，同时表现出干扰素反应和炎症反应基因特征的下调，表明TDLN中存在免疫抑制微环境。
3. B细胞的分析显示TDLN中边缘区B淋巴细胞的下调。
4. MMTV-PyMT小鼠成纤维细胞网状细胞（FRC）中氧化磷酸化途径的增强以及包括Prdx3、Ndufa4和Uqcrb在内的相关基因的升高，表明FRC中大量ATP消耗和TCA循环代谢。
总的来说，结果揭示了在自发性乳腺癌模型中单细胞水平的乳腺癌进展过程中TDLN的重编程，并表明免疫调节和代谢转换是乳腺癌细胞制备转移前微环境的关键改变。
文章评价：本文内容不多，测序分析等也均为常规内容，但是对数据的挖掘非常充分，描述了一个完整的关于乳腺癌转移过程中TDLNS的基因重编程现象，以及引起该变化的可能原因的科研故事。
参考文献：
Li YL, et al. Single-cell analysis reveals immune modulation and metabolic switch in tumor-draining lymph nodes. Oncoimmunology. 2020 Oct 19;9(1):1830513.
四、单细胞测序揭示虾血细胞亚群和细胞分化过程
发表期刊：Elife
影响因子：8.140
发表时间：2021.6
研究内容：采用单细胞RNA测序技术，鉴定了日本沼虾6种血细胞和亚群的分子标记，并预测了参与细胞分化的途径，以及其中发挥关键作用的细胞生长因子。另外，通过对差异表达的免疫相关基因的分析，发现这些亚群间存在不同的免疫效应。
样本类型：日本沼虾收集血细胞
样本数量：3只
研究方法：scRNA-seq/short- and long-read RNA sequencing（de novo）
实验设计：见下图
作者对日本沼虾分离的血细胞进行scRNA-seq分析，对血细胞类型进行分类并表征其功能。由于甲壳类动物的简单序列重复的比例极高，高质量的参考基因组很少。于是作者结合短读长和长读长RNA-seq从头组装制备内参基因来解决scRNA-seq分析无参考基因组的问题。作者通过scRNA-seq描述了日本沼虾几千个血细胞的转录图谱并鉴定细胞群体的分子标记和分化途径，另外还发现了在血细胞分化中起关键作用的细胞生长因子。FACS和qRT-PCR结果证实了细胞形态和分子标记的表达情况。
研究结果：
1. 作者对2566个日本沼虾的血细胞进行聚类，得到6个细胞亚群，并预测了细胞亚群的marker和细胞功能。
2. 作者分别探究了6个细胞亚群在凝血、细胞增殖、免疫相关基因的表达情况，并预测了细胞的分化途径，并且发现了几种生长因子参与了血细胞的分化和成熟。
3. FACS和qRT-PCR结果证实了细胞形态和分子标记的表达情况。
文章评价：甲壳类动物在单细胞领域的研究非常少，一方面受制于没有高质量的基因组，另一方面细胞图谱的信息也非常少。人们对于甲壳类动物的细胞功能、免疫途径等相关信息知之甚少。本文开创性利用了de novo组装的基因全长，并筛选高表达基因作为单细胞分析的参考基因组，实现了单细胞在甲壳类动物中的研究。为人们更清晰理解细胞功能、分子变化，以及细胞成熟和分化的途径、细胞免疫等知识体系提供了帮助。本研究是单细胞测序技术在非模式物种应用的一个成功案例！
参考文献：
Koiwai K, et al. Single-cell RNA-seq analysis reveals penaeid shrimp hemocyte subpopulations and cell differentiation process. Elife. 2021 Jun 16;10:e66954.
五、单细胞测序确定一类调节骨微环境的独特的脂肪细胞类群
发表期刊：Elife
影响因子：8.140
发表时间：2020.4
研究内容：作者通过单细胞转录组测序描述了年轻、成年和衰老小鼠的骨髓细胞谱系和分化途径，并发现一种独特的脂肪前体细胞类型，在维持骨髓血管系统和骨稳态方面起着关键作用。
样本类型：骨内膜Td+骨髓细胞
样本数量：Col2:Td雄性小鼠：1-month-old (n = 2), 1.5-month-old (n = 3), 3-month-old (n = 3) ,16-month-old (n = 3)
研究方法：scRNA-seq
实验设计：见下图
作者对不同年龄的Col2:Td雄性小鼠，分离Td+骨髓细胞，然后进行scRNA-seq，目标捕获约1万个细胞。通过对聚类的细胞进行鉴定，得到骨髓间质的细胞图谱。对成骨和成脂两大类细胞进行拟分化的研究，探究分化途径，并得到分化节点的关键基因的表达信息。对不同年龄分组的研究进一步得到年龄相关的细胞类群。最后作者发现了一类新的成脂细胞类群，在维持骨髓血管系统和骨稳态过程中发挥关键作用，并通过荧光成像技术等进行验证。
研究结果：
1.小鼠内膜骨髓细胞的scRNA-seq，通过Seurat对基因表达谱进行无监督聚类，确定了22个分群，包括9类间充质细胞、11类造血细胞、1类内皮细胞和1类壁细胞。
2.通过拟时序分析发现一类细胞群，命名为早期间充质祖细胞(EMPs)，向骨细胞(Ocy)和脂肪细胞(AD)分化。EMPs表达几种常见的干细胞标记物，如Sca1、Cd34和Thy1等。另外文章也揭示了成脂分化和成骨分化中转录因子的表达情况，包括主调控因子Pparg和Cebpa，以及一些已知的与脂肪形成相关的转录因子，如Klf2、Ebf1和Ebf2等。
3.对不同年龄组的细胞分析显示，在衰老样本中，具有双系（成骨、成脂）分化能力的间充质祖细胞显著减少，而脂肪细胞数量显著扩大。表明衰老过程中，EMPs向更多的成脂状态转移。
4.有意思的是，作者在年轻小鼠中发现了一类表达脂肪细胞标记物的细胞簇(包括Pparg、Cebpa、Adipoq、Apoe和Lpl)，然而却不表达编码脂滴包覆蛋白的基因Plin1，而且编码脂肪酸结合蛋白的基因Fabp4的水平非常低，这意味着它们不含脂滴。通过Adipoq-Cre报告小鼠和细胞分化实验进一步证实了这类细胞在骨髓血管系统和骨髓形成中发挥重要作用，作者将这类细胞命名为骨髓成脂前体细胞(MALPs)。
文章评价：本文揭示了小鼠内膜骨髓的细胞图谱，以及早期间充质祖细胞分别向成骨、成脂两谱系的分化途径和转录因子等分子层面的变化，值得注意的是发现了一类新的成脂细胞类群，在维持骨髓血管系统和骨稳态过程中发挥关键作用。文章整体的行文逻辑非常清晰，在骨髓细胞命运的情况和分化过程中分子边
参考文献：
Zhong L, et al. Single cell transcriptomics identifies a unique adipose lineage cell population that regulates bone marrow environment. Elife. 2020 Apr 14;9:e54695.
六、用于肝细胞癌RNA液体活检的单细胞和血浆RNA测序
发表期刊：Clinical Chemistry
影响因子：8.321
发表时间：2021.8
研究内容：通过单细胞转录组学分析和血浆RNA测序寻找肝癌标志物
样本数量：14名肝细胞癌患者，8名健康对照者，23名慢性HBV感染伴随肝硬化参与者，18名慢性HBV感染者
样本类型：相对应的肿瘤-癌旁组织样本，外周血样本
实验方法：单细胞转录组测序+外周血RNA测序
实验设计：见下图
作者首先对4对肝细胞癌-癌旁组织进行单细胞测序，鉴定肿瘤组织和正常肝组织的细胞类型以及标记基因。另外作者再对18名健康对照者、23名慢性HBV感染伴随肝硬化患者、18名慢性HBV感染者以及4名肝细胞癌患者（包括术前术后）的外周血样本进行转录组测序。对单细胞测序中鉴定出来的差异基因与外周血转录组测得的差异基因进行比较筛选验证，筛选潜在的血浆mRNA标志物。
研究结果：在研究中对4个肝细胞癌肿瘤组织及其配对的相邻非肿瘤组织进行单细胞测序，确定了 6 个主要细胞簇，包括肝细胞样、胆管样细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞、淋巴样和髓样细胞簇。通过细胞类型特异性基因特征（CELSIG）对不同实验组测得的血浆mRNA进行分析发现肝细胞癌患者术前血浆mRNA样本中肝细胞样细胞的CELSIG评分相对其它组别显著升高，术后患者则发生下调。通过 ddPCR 分析进一步验证了血浆 RNA 中的肝细胞特异性转录标记。
文章评价：这篇文章通过单细胞测序和血浆中转录组测序开发了一种非侵入式的肿瘤生物标记物鉴定方法，迎合了当下肿瘤诊断及预后标志物筛选的热点。文章图标文字较为精炼，对于未接触过单细胞测序的读者来说毫无压力。
参考文献
Vong JSL, et al. Single Cell and Plasma RNA Sequencing for RNA Liquid Biopsy for Hepatocellular Carcinoma. Clin Chem. 2021 Nov 1;67(11):1492-1502.
七、解析胃癌前期病变和早期胃癌的单细胞转录组网络
发表期刊：Cell Reports
影响因子：9.423
发表时间：2019.5
研究内容：通过单细胞转录组测序技术解析早期胃癌早期上皮细胞图谱
样本数量：9名患者（非萎缩性胃炎；慢性萎缩性胃炎；肠上皮化生；早期胃癌）的13份胃窦黏膜活检组织
样本类型：活检组织
实验方法：单细胞转录组测序
实验设计：见下图
作者首先收集了9个患者包括非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生，早期胃癌的13个胃窦黏膜活检组织进行单细胞转录组测序，根据测到的32332个高质量细胞数据进行细胞图谱的绘制。接着作者系统性的分析了不同病变上皮细胞的基因表达谱以及后期验证。
研究结果：文章首次描绘了非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和早期胃癌患者的胃粘膜单细胞图谱。对于上述的胃癌相关病变类型，作者确定了不同细胞类型的基因表达特征，分析了某些细胞的转录组变化。最后作者针对肠上皮化生和早期胃癌的特征细胞：杯状细胞（goblet cells），赘生性细胞（neoplastic cells）进行深入分析，确定了这些细胞相关的特异性标志物，在临床上具有潜在的应用价值。
文章评价：细胞特征对于识别胃癌前期病变和恶性病变至关重要，目前在这些病变胃粘膜中完整的细胞类型以及分子特征上不明确，阻碍了胃癌发病机制的研究。在本文中作者不仅描绘了胃癌前期恶性组织的单细胞图谱描述了分子特征还筛选验证了多个特异性标志物，有助于我们对早期胃癌发作机制的了解。
参考文献
Zhang P, et al. Dissecting the Single-Cell Transcriptome Network Underlying Gastric Premalignant Lesions and Early Gastric Cancer. Cell Rep. 2020 Mar 24;30(12):4317.
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