snRNA-seq时代已经到来，别再埋没冻存样本了！|单细胞专题
单细胞RNA-seq(scRNA-seq)已经成为探究复杂组织中细胞类型、分子变化和细胞功能的重要手段。然而，单细胞技术要求从新鲜组织中制备单细胞悬液，获得较高的细胞活性和细胞质量，而-80度冰箱海量的冻存样本因为无法制备高质量细胞悬液而无法应用于单细胞测序，这是限制单细胞技术广泛应用的主要障碍。为了解决冻存样本的单细胞应用问题，研究人员开发了单细胞水平上的核转录组测序（snRNA-seq），被证明是较好的技术方案。
1. snRNA-seq的应用潜力
在Pubmed上检索“single nucleus seq”关键词，截至2022年5月能够找到806篇见刊的单细胞核测序文章，其中2020、2021近两年占到了371篇，涉及到各类型组织。也就是说，snRNA-seq技术在近两年已经被研究人员广泛应用。考虑到检索方式的不全面性，以及尚有部分研究成果未见刊，见微知著，snRNA-seq的应用潜力是非常巨大的！
早在2013年10月美国克雷格·文特尔研究所在一篇PNAS文章上就提出了单细胞核转录组测序的方法，该研究的对象是小鼠脑齿状回组织的神经前体细胞，核转录组测序有效地解决了神经组织样本很难制备完整的单细胞问题，以及避免了由于酶解引起的基因表达变化。另外通过与细胞转录组比较发现，核转录组的变异性低于细胞转录组！
Grindberg RV, et al. 2013
2016年6月Science杂志发表了人冻存脑组织的单细胞核测序的研究，临床上人脑组织很难通过获得新鲜样本即时开展单细胞研究，人死后冻存脑组织通过细胞核测序成为可能。细胞核测序在冻存脑组织中鉴定到了已知的和稀有的神经细胞亚型，表明核测序在细胞组分鉴定和基因检测上的价值。
Lake BB, et al. 2016
2017年10月Nature Methods杂志发布了Broad研究所张锋&Aviv Regev团队开发的新技术—DroNc-seq单细胞表达谱分析技术，该技术融合了sNuc-seq技术与微流控技术的单细胞核RNA测序方法，可以在结构复杂的组织或者冻存组织中更有效地分析大量细胞/细胞核中的RNA，开启单细胞核测序的规模化时代。作者利用DroNc-seq对小鼠/人脑组织进行了分析，并与Drop-seq、sNuc-seq以及其他较低通量的单细胞RNA-seq方法进行比较，结果显示DroNc-seq表现出了灵敏、高效且无偏向的细胞分类能力。该技术将为实现细胞图谱计划项目奠定了技术方案。
Habib N, et al. 2017
2019年1月J Am Soc Nephrol杂志，作者通过对小鼠炎症纤维化的肾脏进行scRNA-seq和snRNA-seq，确认后者比前者更具优势，主要体现在：①snRNA-seq捕获了更多的肾脏细胞，包括肾小球足细胞、系膜细胞和内皮细胞；②snRNA-seq未检测到应激反应基因的表达；③snRNA-seq鉴定到了罕见的细胞类型：表达增殖和损伤marker的两种近端小管细胞类群，以及促进/抑制肾纤维化的两种成纤维细胞类群。总结下来，就是snRNA-seq比scRNA-seq更能全面展示炎症纤维化肾脏的细胞特征和分子表达特征。
Wu H, et al. 2019
2019年12月Nature Communications杂志，研究的是人视网膜，作者提出了困惑，临床上不容易拿到人视网膜样本，而且很难实现马上进行组织解离，所以细胞活性很难达到较高的水平。广大的临床研究人员是不是也面临同样的问题？另外，作者对解离本身也可能导致转录的变化表示担忧。因此作者选择了单细胞核测序，对三个冻存的人供体视网膜组织的外周和黄斑区的 snRNA-seq，鉴定到了视网膜中所有7种主要的细胞类型(杆状、锥状、MG、HC、HC、AC、BC和RGC)。为了进一步评估基因表达层面的准确性，作者同时进行了同类型组织的bulk RNA-seq，snRNA-seq和bulk RNA-seq非零基因的表达相关性达到了0.66~0.71。正如作者所说，snRNA-seq在冻存样本中研究细胞层面的表达谱具有很强的技术竞争力和稳定性。
Liang Q, et al. 2019
2020年5月Natural Medicine杂志，作者研究的对象是非小细胞肺癌(NSCLC)、神经母细胞瘤(NB)、转移性乳腺癌(MBC)、胶质母细胞瘤(GBM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、卵巢癌、儿童肉瘤和黑色素瘤等8种类型肿瘤组织，比较了新鲜样本scRNA-seq和冻存样本snRNA-seq技术在细胞/细胞核质量，以及细胞组分等方面的差异，两种技术均非常完美地复现了各类肿瘤的细胞类型和分子表达。作者提到，snRNA-seq可以作为多种肿瘤研究的重要补充手段！
Slyper M, et al. 2020
2021年2月bioRxiv预印本发布了由于感染SARS-CoV-2死亡的17例患者的11个器官的单细胞核图谱和空间转录组图谱，构建了COVID-19感染宿主的细胞图谱数据集，并揭示了组织病理和细胞分子机制，为新的治疗干预措施和预防策略提供支持。可见snRNA-seq技术在珍贵样本开展研究中的巨大潜力！
Delorey TM, et al. 2021
在2020年9月的Cell Reports杂志提出了snRNA-seq 的缺陷，文章研究的是阿尔兹海默症的脑皮质样本，scRNA-seq未能检测到阿尔兹海默症小胶质细胞激活相关的基因。尽管大多数基因在细胞和细胞核中表现出相似的相对丰度，但细胞核中有一小部分基因（1%）未被检测到，如APOE, CST3, SPP1等等，这些基因占以往研究中已经确定的小胶质细胞疾病相关基因的18%。因此文章得出结论：snRNA-seq不适合小胶质细胞中激活相关基因的检测！
Thrupp N, et al. 2020
2. snRNA-seq的特点
1）关于scRNA-seq的缺点总结如下：
Need for fresh samples：仅适用于新鲜样本
Loss of cell types by death or inadequate dissociation.：过解离或者解离不充分造成的细胞丢失或细胞偏好性
Transcriptional stress responses induced during tissue digestion：酶解过程引入的应激基因的表达
Not suitable for large size cells：不适用于含大细胞的组织
2）关于snRNA-seq的优势总结如下：
Allows transcriptomic profiling of frozen tissue：适用于冻存样本
Improves dissociation bias：改善细胞偏好性
Eliminates artifactual gene expression：消除人为引入的基因表达
Provides similar gene detection compared with scRNASeq：与scRNA-seq具有类似的基因检测率
Accessible for large size cells：支持含大细胞的组织
3）关于snRNA-seq的劣势总结如下：
Low sensitivity of detecting specific genes under certain conditions：特定条件下某些基因的检测敏感性降低
4）关于snRNA-seq的应用场景
冻存样本（-80度冰箱里的宝藏）
难解离样本（胰腺、脂肪、肝脏、肾脏、脑神经等）
含大细胞样本（>40um）（脑：神经节，心脏：心肌细胞，肌肉：骨骼肌，脂肪：成熟脂肪细胞等）
临床珍贵样本（取样受到时间、空间限制）
snRNA-seq相比scRNA-seq在样本丰富度上更有优势，不再仅局限于新鲜样本，也适合与一些难解离样本，同时开拓了冻存样本的利用。从细胞分析结果上看，snRNA-seq能够减少酶解过程人为诱导的细胞类群偏好性的问题，且针对在解离时容易造成细胞死亡以及解离难度大的样本，如肝脏、胰腺、脂肪等，用snRNA-seq也更合适。
但是snRNA-seq也存在检测基因少、免疫细胞占比低等问题。另外，抽核面临的主要难点是在保证核膜完整的前提下尽量去除细胞碎片和杂质，因此不同的组织提核的条件需要摸索。此外，不论snRNA-seq还是scRNA-seq，对细胞核/细胞的RNA完整性要求均很高，所以选择抽核的冷冻样本，冷冻前样本情况、冷冻后的保存情况对RNA质量均有较大影响，并不是所有冷冻样本都能构开展snRNA-seq。
总之，snRNA-seq与scRNA-seq两种方法各有优劣，需要根据实际样本类型、研究目的、目标细胞群体等条件选择合适的方法。
3. snRNA-seq已经开展研究的样本类型
snRNA-seq在不同类型的样本研究中被广泛应用，包括脑、不同脑区，心脏，肾脏，肌肉，肝脏，肺，胰腺，脂肪，胎盘迷宫，视网膜，血管，以及PBMC和细胞系等。以下整理了snRNA-seq应用于不同样本类型的文献一览表：（滑动查看）
4. 细胞vs细胞核基因检出率的比较
关于scRNA-seq和snRNA-seq的比较，人们往往会关注到基因检出率的问题。毕竟一个是检测整体细胞（包括细胞内的细胞器）内的转录本，以细胞质内大量的转录本为主；一个是检测细胞核内的转录本，常规的认知肯定是前者的基因/转录本检出率要高于后者，那实际的情况是否如此？接下来的内容将要打破这一惯性认知！
我们做了一些调研，希望找到一些权威的论据来回答这个问题。终于发现，早在2014年8月，一篇BMC Genomics杂志的文章就给出了答案，这个答案也让我们非常震惊！这篇文章研究的是不同RNA提取方法（TRIzol vs Qiagen；细胞质RNA vs 细胞核RNA），不同建库方法（PolyA+链特异性建库vs RiboZero链特异性建库）对于HEK293细胞转录组影响的比较，维度比较多，我们抓住一些核心的信息。
From 20,234 annotated protein-coding genes, 62% were found expressed (rpkm≥0.5) in the nucleus and 60% in the cytoplasm of HEK293 cells.
该描述表明，在20,234个总的检出基因中，细胞质与细胞核所占的比率差不多，也就是说，细胞质和细胞核的基因检出率是差不多的。
The 465 genes found only in the cytoplasmic fraction were in majority low expressed genes (average 1.2 rpkm), and could be detected in the nuclear fraction albeit below the detection threshold (average 0.3 rpkm).
该描述表明，465个基因只在细胞质中检测到而未在细胞核中检测到，这些基因均是低表达的基因。也就是说对于细胞质vs细胞核，细胞质中额外的检出的基因均是低丰度基因，而表达量较高的基因，细胞质和细胞核均能检出。
Overall, a similar number of protein coding genes was detected by all methods.
该描述表明，总体来说，细胞质和细胞核中检测的基因数量上大致是一样的。
Sultan M, et al. 2014
基于以上的观点，我们推测scRNA-seq和snRNA-seq在基因的检出率上不会相差太多。我们实际的项目经验也发现，如果不考虑低丰度基因过滤的问题，两种方式确实在基因检出率上相似。
其实不难想象，对于细胞核与细胞质的关系，就好比是“初级原料加工厂”和“产品包装厂”的关系，初级原料加工厂源源不断给产品包装厂运输大量的中间产品，这个过程是持续动态的，也就是说初级原料加工厂中肯定会保留各种产品的原始信息，snRNA-seq和scRNA-seq就好比是质检部门，分别检测“初级原料加工厂”的产品信息和“产品包装厂”的产品信息，这两个工厂的产品信息重叠度会非常高，只是说产品的数量（类比基因的丰度）可能会有差异。这样我们就很容易能够理解scRNA-seq和snRNA-seq在基因的检出率上不会相差太多这个观点了！
5. snRNA-seq vs scRNA-seq数据比较
联川开展了非常多的snRNA-seq项目，以下展示了一批snRNA-seq vs scRNA-seq数据质量比较。该数据样本对象是小鼠大脑皮层，分别是3例抽核 vs 3例解离，基于10x Genomics平台进行细胞捕获，两种方式的测序数据比较如下：
1）数据质量指标
可以得出以下结论：
抽核和解离两种方式在捕获细胞/细胞核数量、平均细胞reads、基因中位数，以及检测的总基因数等方面相差不大。
从大量测试数据来看，snRNA-seq检测的细胞基因中位数或多或少会低于scRNA-seq的方式，当然这个情况也可能归因为低丰度基因过滤的问题。
不过Wu H, et al. 2019表示scRNA-seq检测到的转录本有高于24%是来源于线粒体细胞器，或者由于酶解诱导的应激基因表达的转录本。
从这个层面来说，snRNA-seq检测的基因信息并不逊色于scRNA-seq的方式。
2）捕获的细胞类型
可以得出以下结论：
解离的方式会造成免疫细胞的比率增大，显示出细胞偏好性。
相反，抽核能拿到更多的神经元细胞，能够反映组织最真实的细胞组分。
snRNA-seq有自身的优势，也可以作为scRNA-seq的互补手段，以实现全面描述组织最真实的细胞组分和基因表达状态（Slyper M, et al. 2020）。
6. 细胞核提取实验方法
（Habib N, et al. 2017; Wu H, et al. 2019）
细胞核分离裂解液：采用EZ裂解缓冲液（NUC-101, Sigma-Aldrich），并添加蛋白酶抑制剂（5892791001, Roche）和RNase抑制剂（N2615, Promega和AM2696, Life Technologies）。
具体步骤如下：
1) 将组织加到1ml EZ裂解液+1ml PBS混合液中，剪碎成~0.1 cm的小块，PBS管内沉降清洗2次，弃上清；
2) 加入2 ml预冷的裂解液冰上预裂解2min；
3) 用Dounce 匀浆器（885302-0002, Kimble Chase）进行匀浆，移液器温和地上下吹打匀浆5-6次；
4) 冰上孵育6min，加入2ml预冷的4% BSA稀释，巴氏吸管吹打6-8次，终止反应；
5) 5.4℃，300 g离心5min；
6) 用2 ml裂解液+4%BSA重悬，冰上孵育3min；
7) 去除碎片（FACS）；
8) 沉淀采用4 ml上述裂解液+4%BSA缓冲液重悬，在冰上孵育5min。随后，4℃，300 g离心5min;
9) 细胞核沉淀缓冲液重悬（1×PBS，0.07% BSA和0.1% RNase抑制剂)；
10)20um细胞筛（43-50020-50, pluriSelect）过滤细胞核悬液，收集最终的悬液，采用血细胞计数板或者Countess II自动细胞计数仪测浓度并计数，最适浓度调整为700-1200 nuclei/ul。
7. 联川平台优势
流式细胞仪最直接的帮助是在抽核实验上。对于抽核的样本来说，常会碰到一些解离后破碎的大的细胞器（例如：线粒体）或者细胞碎片，无法通过离心的方法与细胞核进行区分，造成核悬液背景非常差！此外，对于抽核样本来说，由于细胞核具有大量的DNA和RNA，并且在特殊的离心和高钙环境的条件下，极容易造成细胞核之间的抱团和黏连体，并且通过离心等条件也是很难有较大改善的。
联川引入BD Aria系列流式细胞仪，能解决核制备存在的问题，去除核悬液碎片，Ambient RNA，纯化细胞核悬液，为单细胞核测序保驾护航，推动单细胞研究进入核测序时代！
参考文献（滑动查看）
1.Grindberg RV, et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Dec 3;110(49):19802-7.
2. Lake BB, et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 2016 Jun 24;352(6293):1586-90.
3. Habib N, et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nat Methods. 2017 Oct;14(10):955-958.
4. Wu H, et al. Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis. J Am Soc Nephrol. 2019 Jan;30(1):23-32.
5.Liang Q, et al. Single-nuclei RNA-seq on human retinal tissue provides improved transcriptome profiling. Nat Commun. 2019 Dec 17;10(1):5743.
6.Slyper M, et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 2020 May;26(5):792-802.
7.Delorey TM, et al. A single-cell and spatial atlas of autopsy tissues reveals pathology and cellular targets of SARS-CoV-2. bioRxiv [Preprint]. 2021 Feb 25:2021.02.25.430130.
8.Thrupp N, et al. Single-Nucleus RNA-Seq Is Not Suitable for Detection of Microglial Activation Genes in Humans. Cell Rep. 2020 Sep 29;32(13):108189.
9.Sultan M, et al. Influence of RNA extraction methods and library selection schemes on RNA-seq data. BMC Genomics. 2014 Aug 11;15(1):675.
关于联川
杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。单细胞测序作为联川战略发展方向，在组织解离和单细胞生信分析方面充分发挥自身优势，为客户提供优质的服务。目前已经与100多个国家及地区的科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞测序相关的SCI论文近50篇，影响因子平均15+。
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