组织解离实验秘籍，你不知道的这里都有！|单细胞专题
动物组织由细胞外基质（ECM）和嵌入细胞外基质的细胞组成。细胞外基质是细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质构成的复杂网络结构，支持并连接组织、调节组织的发生和细胞的生理活动。细胞外基质主要由三大部分构成：1）糖胺聚糖（glycosaminoglycan）、蛋白聚糖（proteoglycan），它们可以形成水性胶状物，包埋其他基质成分；2）结构蛋白，包括胶原蛋白（collagen）和弹性蛋白（elastin）等，它们赋予细胞外基质一定的强度和韧性；3）黏着蛋白，包括纤黏连蛋白（fibronectin）和层黏连蛋白（laminin），促使细胞和基质结合。像上皮组织、脑和脊髓、肌肉组织ECM含量较少，而结缔组织中ECM含量较高。ECM的组分和组装形式由它们所产生的的细胞决定，并与组织功能相适应。
图1 ECM构成示意图
组织解离的本质：通过机械破坏或者酶消化的方式，首先破坏细胞外基质，将细胞从细胞外基质中释放出来，然后再破坏细胞与细胞之间连接，才能获得单细胞悬液。
依照样本类型不同，需要配置不同的酶混合物，将切碎的组织块置于消化酶混合物中并在特定温度下孵育进行酶解离。不同的最佳酶活性一般具有温度特异性，因此在给定温度下能够以最高效率解离组织，通常酶解温度为37℃，也可以在4℃或冰上进行，这取决于所用酶的性质。一般较低的孵育温度会降低酶的反应速度从而延长酶解时间，但低温孵育可以减少细胞死亡。选择消化酶混合物用于制备用于单细胞悬液时，酶活强度、酶浓度以及孵育时间是最重要的三个考虑因素，三个因素间的变化可能导致细胞活性和细胞产量的波动。
胰蛋白酶（trypsin）、木瓜蛋白酶（papain）是破坏细胞连接的酶（搭配DNase-I）；弹性蛋白酶（elastase）、透明质酸酶（hyaluronidase）、胶原酶(collagenase)、中性蛋白酶(dispase)是分解细胞外基质的酶。解离能力比较：胰蛋白酶>木瓜蛋白酶>弹性蛋白酶>透明质酸酶>胶原酶>中性蛋白酶。
图2不同酶解离能力和功能比较
（一）分解细胞外基质的酶
1) 弹性蛋白酶（elastase）：弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，同时表现出酯酶和酰胺酶活性。尽管弹性蛋白酶可以水解多种蛋白底物，但其水解天然弹性蛋白的能力在蛋白酶中是独一无二的，天然弹性蛋白是一种不受胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶攻击的底物。由于弹性蛋白在结缔组织的弹性纤维中含量最高，所以弹性酶常被用来分离含有大量细胞间纤维网络的组织。为此，它通常与其它酶如胶原酶、胰蛋白酶一起使用。
2) 透明质酸酶（hyaluronidase）：透明质酸酶是一种具有2-乙酰氨基乙酰胺-2-脱氧-d-葡萄糖和d-葡萄糖醛酸盐之间存在的N-乙酰己糖氨基内键特异性的多糖酶。这些化学键在透明质酸和硫酸软骨素A和C中很常见。因为这些物质在几乎所有结缔组织的基质中浓度很高，所以透明质酸酶常被用来分解这些组织，通常与粗蛋白酶如胶原酶结合使用。
3) 胶原酶(collagenase)：胶原酶更准确地名称为梭菌肽酶A，在Pro（脯氨酸）-X-Gly（甘氨酸）-Pro序列中特异性破坏的X-Gly键（X通常是一种中性氨基酸）。这类序列常在胶原蛋白中发现，但在其他蛋白质中很少发现。虽然许多蛋白酶可以水解单链变性的胶原多肽，但胶原酶在众多蛋白酶中是独一无二的，它能够攻击和降解结缔组织中常见的三螺旋天然胶原纤维。胶原酶破坏胶原蛋白中存在的肽键，有助于消化细胞外基质，使细胞释放到悬浮液中。
4) 中性蛋白酶(dispase)：中性蛋白酶是由多肉芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)产生的一种细菌酶，水解非极性氨基酸残基的N端肽键，属于氨基内肽酶。中性蛋白酶只能破坏细胞外基质而不破坏细胞之间的连接，因此主要用于细胞集落的分离和将组织块分解成小块细胞，因为它保持细胞膜的完整性，其温和的蛋白水解作用使酶可以被特异性用于分离原代细胞和次级细胞（亚培养）。中性蛋白酶也常被用作与胶原酶和/或其他蛋白酶结合的次级酶，用于许多原代细胞的分离和组织解离。中性蛋白酶可以破坏细胞表面的分子或者抗原，例如与T细胞分析相关的抗原。因此，如果发现细胞某些表位蛋白的丢失，可以从消化液中将该酶去掉。
（二）破坏细胞连接的酶
1) 胰蛋白酶（trypsin）：胰蛋白酶是一种胰脏丝氨酸蛋白酶，是已知的最高度特异性的蛋白酶之一，尽管它也表现出一定的酯酶和酰胺酶活性。单独纯化的胰蛋白酶对细胞外蛋白的选择性较低，通常对组织的解离效果不佳。纯化的胰蛋白酶和其它酶如弹性蛋白酶和/或胶原酶的组合已被证明对解离有效。胰酶能够降解细胞连接中存在的某些蛋白，但是胰酶对细胞膜上蛋白有很强的破坏作用，容易造成DNA的泄漏，游离DNA很有容易诱导细胞成聚体，因此经常与DNase-I搭配使用。
2) 木瓜蛋白酶（papain）：木瓜蛋白酶是一种来自木瓜胶乳的巯基蛋白酶。木瓜蛋白酶具有广泛的特异性，对大多数蛋白质底物的降解作用比胰腺蛋白酶更广泛，它还表现出酯酶活性。使用木瓜蛋白酶常用于神经组织等分离。木瓜蛋白酶与胰酶类似也能够使细胞溶解并释放游离DNA，因此经常与DNase-I搭配使用。
（三）DNA消化酶
细胞悬液中游离DNA的存在DNA存在会降低蛋白酶活性，同时游离DNA作为粘合剂会促使细胞聚团，因此需要使用DNA消化酶消化游离DNA。DNA消化酶主要有两种类型：DNase-I和DNase-II。DNase-II在降解DNA的同时，也会造成细胞凋亡，因此不适合制备单细胞悬液。DNase-I适用于组织消化和制备单细胞悬浮液，它可以通过降解死细胞裂解释放的游离DNA阻止细胞聚集，同时不会启动凋亡途径。
不同解离酶的使用范围
酶种类 | 使用范围 |
Ⅰ型胶原酶 | 上皮，肺，脂肪和肾上腺等组织 |
Ⅱ型胶原酶 | 骨，软骨，肝，心脏，肌肉，甲状腺和唾液腺等组织 |
Ⅲ型胶原酶 | 乳腺组织等 |
Ⅳ型胶原酶 | 胰岛细胞，髓系细胞等 |
胰蛋白酶 | 需配合胶原酶或弹性蛋白酶一起使用 |
中性蛋白酶 | 常与胶原酶或其他蛋白酶结合使用 |
弹性蛋白酶 | 肺泡Ⅱ型细胞等 |
透明质酸酶 | 常与胶原酶等天然蛋白酶联合，用于解离结缔组织 |
木瓜蛋白酶 | 皮层神经元，视网膜，平滑肌等 |
联川基于多年的样本制备经验，结合各类组织的特性，开创性地将组织划分为四大类型：实质脏器；腺体；脉管；神经组织。
（一）四大类型对应的组织
1）实质脏器包含：心脏、肺、肾、肝、脾、胆囊、胃、肠、膀胱、子宫、卵巢等类型组织；
2）腺体包含：松果体、脑下垂腺、甲状腺和副甲状腺、扁桃腺、下颌腺、舌下腺、唾腺、腮腺、胸腺、肾上腺、胰腺、前列腺等类型组织；
3）脉管包含：支气管、气管、喉管、静脉管、动脉管、输尿管、输卵管、输精管、淋巴管、半规管等类型组织；
4）神经组织包含：大脑、间脑、脑干、中脑、桥脑、延髓、小脑、脑室、脉络丛、海马、伏核、额叶皮层、后极区、丘脑、脊神经等类型组织。
（二）四大类型组织解离特点
1）实质脏器：表面带有包膜，细胞黏连，细胞类型丰富，容易凋亡，解离实验中需要增加额外的清洗步骤。酶的选择和酶解时间至关重要。一般选用胶原酶、木瓜蛋白酶、DNase-I等混合酶，设置适当的消化时间进行解离实验。
2）腺体：细胞种类复杂、脆弱，细胞容易凋亡，一般添加海藻糖保护细胞膜。精确酶的种类和浓度是解离的关键。一般选用胶原酶、中性蛋白酶等温和酶进行解离实验。
3）脉管：细胞连接紧密，难解离，解离的碎片多。酶解时间把握是关键。选用胰蛋白酶、胶原酶等烈性酶搭配DNase-I进行样本制备。
4）神经组织：神经纤维非常粘，海藻糖保护细胞膜。前期的样本分离提纯很关键。解离实验采用木瓜蛋白酶等破坏细胞连接的酶搭配DNase-I。
（三）组织解离方案概述
人肺组织：2ml的混合解离酶浓度分别为：胶原酶Ⅰ、IV: 1mg/ml；中性蛋白酶：1mg/ml；DNAseⅠ：1.4mg/ml；37℃，20min后用10%的FBS终止消化。
人肝脏组织：胶原蛋白酶TypeⅠ和Ⅳ各1mg/ml，DNaseⅠ：60ul/5ml，木瓜蛋白酶：20U/ml，37℃消化30min。
人甲状腺组织：胶原酶Ⅱ：1mg/ml，中性蛋白酶：2.5mg/ml，DNaseⅠ：25U/ml，DMEM，37℃消化30min。
人动脉组织：透明质酸酶：100U/ml浸泡2min；混合酶液：胶原酶Ⅰ1.5mg/ml，弹性蛋白酶8U/ml，中性蛋白酶1.18U/ml。
人食管组织：0.25%胰蛋白酶，5min，去胰酶；100U/ml，TypeⅡ和2U/ml的中性蛋白酶及DNaseⅠ：25U/ml，37℃消化30min。
人下丘脑：木瓜蛋白酶：20 U/ml，1ml 解离液15min，37℃，15min(吹打10次)+5min。
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1) 样本解离最佳环境
在洁净工作台等无菌环境中解离组织，使用无核酸酶的试剂和耗材。组织样本在恒温消化前、形成细胞悬液后应始终在放置在冰上。
2) 影响细胞质量的因素
实验的关键在于保持细胞的活率，最小化细胞悬液的制备时间，准确测定细胞浓度并将正确的体积吸取到每个反应中。理想情况下，细胞悬液应含有90％以上的活细胞。死细胞和濒临死亡的细胞通常会带来背景碎片和片段化RNA污染，造成数据质量差。
细胞悬液在使用前长时间放置，可能会导致细胞活力大大降低。某些类型的细胞（例如外周血单核细胞PBMC）在PBS中放置较长时间后会形成细胞团。这种细胞团不容易通过移液器吹打分离成单个细胞，这会降低细胞悬液中单个细胞的有效浓度。因此，细胞悬液应在制备后尽快完成上机捕获，最好控制在30分钟内。
3) 移液器及枪头使用
为了最大程度地减小剪切力对细胞的物理损害，在细胞重悬过程中应轻缓地吹打细胞悬液和移液。特别是使用常规孔径的移液器吸头时，轻缓地吸移细胞悬液尤为重要，因为小孔径更容易剪切和损坏细胞，而且细胞悬液通过枪头尖端的速度越快，对细胞的损伤也越大。
因此，在吹打、移液步骤中尽使用宽口枪头。但是在最终洗涤步骤后重悬细胞时，可以使用常规口径的枪头轻缓地吹打细胞悬液，因为这样更容易将细胞沉淀、细胞团块吹散，防止细胞结团，产生更高质量的单细胞悬液。
4) 组织清洗-剪切
组织清洗、剪切全程在冰上操作；
使用无菌剪刀、镊子对组织进行清理，去除凝血块、血液、坏死组织、脂肪、纤维、筋膜等非目的组织和杂质；
避免热损伤、化学损伤：新鲜采集的样本很容易被物理损伤（如电刀采集的样本）、化学物质渗透损伤，如果不可避免，应尽可能剔除损伤部分，以免对后续实验造成影响；
将组织剪切至合适大小：1-3mm3，清洗数次，尽量洗去因剪切导致的死细胞、细胞碎片和杂质。
5) 酶消化
酶活强度、酶浓度以及孵育时间是最重要的三个考虑因素，三个因素间的变化可能导致细胞活性和细胞产量的波动。
将组织放入酶解液中，观察悬浮组织颗粒情况及酶液清澈程度（用于后期预估组织消化情况）；
根据组织类型，37℃计时孵育10~20min，观察组织及酶液情况（组织量是否减少，组织边缘是否薄膜化，是否弥散，酶液是否浑浊），判断是否需要继续加时解离，如需加时解离，则每孵育5~10min应及时取出观察组织及酶液情况；
如有以下三种情况中的两种或两种以上出现时，则应立即停止消化进行细胞的清洗富集。
①组织减量1/3时；② 2/3的组织块边缘薄膜化时；③解离酶液浑浊，有颗粒物悬浮。
每次观察后如果以上三种情况未出现或是出现但不显著，可以通过宽口枪头轻柔吹打数次，通过加大液体的流动冲击力，促进细胞解离的效果。
终止消化：要终止消化的组织置于4℃的冰上，加入FBS（体积占比5%）混匀，静置沉降。
6) 离心条件
应针对特定样品类型优化最佳离心条件，理想的离心条件将产生不太紧密堆积的细胞沉淀，上清液中残留的细胞极少，即最小化上清液中的细胞数量。过度离心可能会降低细胞活力， 且紧密堆积的细胞沉淀需要更多次的吹打以重悬细胞，这会产生更多的剪切作用而损坏细胞。
推荐的初始离心条件是：对于较大的细胞（如神经元等），4℃、150 rcf离心3分钟；对于较小的细胞（如一些免疫细胞），4℃、300 rcf离心5分钟。当解离新鲜样本时，离心后保存上清液，如果细胞浓度比预期的要低得多，检查保存的上清液的细胞浓度，如果上清液中存在较多细胞，以更高的离心速度重新沉淀上清液。
注：离心较大的细胞，需要以较低的速度或较短的时间以保持细胞完整性，离心一些非常小的细胞可能需要以更快的速度（例如400 rcf）或更长的时间（例如10或15分钟）离心，以最大程度地减少细胞损失。但是过快的离心速度会损害细胞的完整性和活力。
根据离心转子的类型，细胞沉淀会在离心管的侧面或底部形成，在处理小细胞或细胞量少的样本时，离心后沉淀很难看清，知道细胞沉淀的预期位置，有助于减少吸弃上清液时造成的细胞损失。
7) 洗涤和重悬
推荐的细胞洗涤和重悬溶液为1X DPBS（不含钙和镁），其中含有0.04％重量/体积的BSA（400克/毫升）。添加BSA可以很大程度地减少细胞的损伤和聚集结团。
原代细胞、干细胞和其他敏感细胞类型可能需要洗涤并重悬于其他缓冲液中，以使活力最大化。如有必要，可用最常见的细胞培养缓冲液代替DPBS。
已验证替代缓冲液DPBS、HBSS在对人293T/17和小鼠NIH/3T3细胞系进行分析时不会影响10x单细胞方案的性能。如果细胞无法在以上两种缓冲液中维持细胞活力，则可以在最常见的细胞培养基中洗涤和重悬（也可添加FBS）。已验证以下几种培养基与10x单细胞方案兼容：
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) + 10% FBS
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS
Iscove’s Modified Eagle Medium (IMEM) + 10% FBS
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% FBS
Ham’s F12 + 10% FBS
1:1 DMEM/F12 +10% FBS
M199
洗涤和重悬细胞时，可以近似估计适当的体积的缓冲液进行重悬，细胞计数后再调整重悬体积，以获得目标浓度。如遇到细胞量很少的样本，离心后除去上清液时留下约50μl或适当体积的上清液以达到目标细胞浓度。细胞浓度应始终低于5000 cells/μl，浓度过高会引起细胞结团，影响高质量单细胞悬液的产生。注：重悬后勿颠倒试管，因为细胞会粘附在试管的侧面，从而改变细胞浓度。
8) 过滤
GEM的产生发生在微流孔道中（即<100μm），为确保最佳的系统性能，应注意避免将细胞碎片，纤维等杂质或成团的细胞引入这些孔道中。清除碎片和细胞团对于使用自动计数器进行准确的细胞计数也很重要。如果观察到大量的细胞团块或碎片，可用移液器轻缓吹打10~15次来混合细胞，并使用合适孔径的细胞过滤器过滤细胞悬液，这有助于去除细胞团和碎片。细胞筛的孔径应大于样品中最大细胞的直径，但孔径也应足够小以过滤掉较大的细胞团和碎片。
根据细胞结团程度和细胞过滤器类型，细胞的数量、浓度和细胞悬液的体积会发生变化。对于一般的样本细胞悬液，建议使用MACS SmartFilter，因为它通常会使细胞浓度的变化最小。但是可能会损失100μl或更大体积的细胞悬液。对于细胞悬液体积小的样本，建议使用Flowmi Tip过滤器以最大程度减少体积损失，但是细胞浓度可能降低30％或更多。
9) 细胞结团
细胞结团的产生，容易在GEM生成时堵塞芯片管道导致实验失败，或者增加 GEM多细胞率，降低数据利用率，因此需要在样本制备和细胞悬液清洗、重悬时增加部分操作，降低细胞结团率。
组织解离时添加DNase I。DNA分子黏性较高，在组织解离时部分细胞破碎释放出DNA分子会起到粘合剂的作用聚合细胞，因此需要使用DNase去除游离DNA。需要注意的是，如果DNase没有被清洗干净，在GEM-RT孵育后可能还会保留活性，它们的存在会降解cDNA.
提高细胞悬液BSA浓度。建议的细胞清洗和缓冲液为含0,04%BSA (w/v)的1x PBS(无钙镁离子），提高 BSA浓度（0.1%-2%)不会对单细胞转录组数据结果产生负面影响。
细胞最后一次离心重悬时移液器枪头选择常规口径枪头，移液动作轻缓，利用剪切力分离细胞结团。
上机捕获细胞前，选择合适的细胞过滤器过滤细胞悬液。
10) 单细胞悬液裂红
需要裂红的样本类型：脾脏、肝脏、肺、骨髓，这些脏器中本身含有较大量的血液，在制备单细胞悬液中，红细胞可能会有较高的比例，因此需要进行裂红的操作。
视情况判断是否需要裂红的样本：各类肿瘤样本、PBMC等。
可不裂红的样本类型：脑组织、胸腺、淋巴结、主动脉等一般不需要裂红。
11) 单细胞悬液去除死细胞
对低活性的单细胞悬液要进行去除死细胞操作。Dead Cell Removal Kit 包含MicroBeads(微珠）和用于细胞碎片、死亡细胞和正在死亡细胞的磁标记的结合缓冲液，微珠会识别凋亡以及死亡细胞质膜中的抗原。在采用Dead Cell Removal Kit 去除死细胞时，死细胞会被微珠磁性标记，并通过分离柱。磁性标记的死细胞会保留在柱子上，而未标记的活细胞会从流出液中收集起来。使用Dead Cell Removal Kit，即使是具有完整细胞膜的早期凋亡细胞也会被去除。
当然也可通过FACS去除死细胞，比如用Annexin-V/7-AAD双染的方法通过流式细胞仪，将Annexin-V-7-AAD-的细胞筛选出来，这样就能将死亡或者状态不好的细胞给剔除了。
参考文献
Reichard A & Asosingh K. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry A. 2019 Feb;95(2):219-226.
关于联川
杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。单细胞测序作为联川战略发展方向，在组织解离和单细胞生信分析方面充分发挥自身优势，为客户提供优质的服务。目前已经与100多个国家及地区的科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞测序相关的SCI论文已见刊50余篇，影响因子平均15+。
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