用户文章：肿瘤-睾丸lnc-CTHCC通过结合hnRNP K和激活YAP1转录促进肝癌的发生 | 转录调控专题
论文标题：The cancer-testis lncRNA lnc-CTHCC promotes hepatocellular carcinogenesis by binding hnRNP K and activating YAP1 transcription
刊登日期：2022年01月
发表杂志：Nature Cancer
影响因子：21.937
研究机构：南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科；南京医科大学公共卫生学院；南京医科大学江苏省癌症生物标志物防治重点实验室
技术手段：转录组测序、联川生物Omicstudio云平台
文章架构
样本基础信息
该研究共使用了64例肝癌患者的肿瘤样本，这些患者大多是60岁以下的中青年男性，多为原发性肝癌，并且其中大部分lnc-CTHCC高表达的肝癌组织分化程度处于中晚期。
主要研究内容
图1
该研究首先在GTEx和TCGA数据库中筛选出一个高度保守并且在睾丸和各类癌症中高表达的lncRNA——lnc-CTHCC。作者通过对64例肝癌组织进行分析，发现lnc-CTHCC也在肝癌中高度表达。并在利用特异性lnc-CTHCC探针进行FISH分析后，发现其主要分布于细胞核。此外，肝癌组织中高表达的lnc-CTHCC与OS降低显著相关，表明其与预后不良有关。
图2
该研究利用CRISPR-cas9系统构建了lnc-CTHCC-KO小鼠，并用DEN和CCl4诱导小鼠肝癌生长。通过MRI数据、形态分析、凋亡染色以及CD31染色，发现lnc-CTHCC缺失能够抑制小鼠肝癌生长，并显著降低微血管密度。利用小鼠特异性lnc-CTHCC探针进行FISH分析，发现lnc-CTHCC主要存在于小鼠H22细胞系上皮细胞的细胞核中。
上述结果表明，肝细胞中的lnc-CTHCC在小鼠肝癌发生发展过程中是必不可少的。
图3
此外，该研究通过建立shRNAs-lnc-CTHCC敲除的肝癌细胞稳转株（Hep3B和MHCC97L），发现这些肝癌细胞的生存、增殖以及软琼脂克隆形成能力均受到明显抑制。通过建立肿瘤异种移植模型，生物发光成像显示，lnc-CTHCC基因敲除肿瘤的荧光素酶活性显著降低，并显著抑制肿瘤生长。CD31染色结果显示lnc-CTHCC-基因敲除组的微血管密度显著降低。
接下来，该研究建立了稳定过表达lnc-CTHCC的肝癌细胞稳转株（SMMC7721和MHCC97H）。lnc-CTHCC过表达显著提高了肝癌细胞的存活率、增殖能力和软琼脂集落形成效率，并促进了皮下肿瘤细胞的生长。通过Ki67、CD31染色和血管生成分析，发现lnc-CTHCC过表达能够促进肝癌细胞增殖和微血管密度，并促进血管生成。
图4
随后通过创伤愈合实验和Transwell分析，发现lnc-CTHCC基因敲除显著抑制了肝癌细胞的迁移和侵袭能力，并使肝癌细胞的E-钙粘素上调和波形蛋白下调，导致细胞具有上皮样形态，表明lnc-CTHCC基因敲除抑制了肝癌细胞EMT。而lnc-CTHCC在SMMC7721和MHCC97H细胞中的过度表达显示出相反的结果。
然后将lnc-CTHCC基因敲除细胞注射到小鼠体内，五周后发现下调的lnc-CTHCC显著减少了肝癌的肺转移结节和转移病灶。在注射lnc-CTHCC过表达细胞的小鼠中显示出相反的结果，并缩短了OS时间。
图5
该研究通过FISH和核质分离分析证实lnc-CTHCC主要位于细胞核，然后通过RNA pull-down实验确定lnc-CTHCC与hnRNP K特异结合。随后通过hnRNP K的RIP实验也对这一结果进行了验证。共定位分析发现，lnc-CTHCC与hnRNP K共同定位于细胞核。而lnc-CTHCC的敲除或过表达在转录和蛋白水平上均不影响hnRNP K的表达。
对肿瘤组织标本检测后发现，肿瘤组织中hnRNP K的转录和蛋白水平均显著高于相应的癌旁组织。而TCGA数据显示，肝癌组织中hnRNP K的高表达与OS降低显著相关。通过特定SiRNAs沉默hnRNP K可导致肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力减弱。并且hnRNP K能够补救lnc-CTHCC对肝癌细胞的影响。
这些结果表明hnRNP K在肝癌细胞中具有致癌作用，而lnc-CTHCC可能通过与hnRNP K直接结合而参与肝癌的发生。
图6
接下来，作者通过转录组测序对lnc-CTHCC调控的相关信号通路进行评估，KEGG和GSEA数据显示lnc-CTHCC可能参与调节HIPPO信号，并在该信号通路上的候选基因中确定了关键基因YAP1。进一步分析发现，lnc-CTHCC促进了肝癌组织中YAP的表达。
然后，作者通过CHIP分析，发现hnRNP K与YAP1启动子区域结合。Si-hnRNP K抑制了Hep3B细胞中Y AP的表达水平。此外，lnc-CTHCC基因敲除减少了YAP1启动子区结合的hnRNP K的数量。荧光素酶分析表明，hnRNP K基因敲除抑制了lnc-CTHCC过表达细胞中YAP的表达水平。
YAP基因在肿瘤组织中高表达，与lnc-CTHCC在肝癌细胞中的表达呈正相关。肝癌组织中YAP表达水平的升高也与OS降低显著相关。此外，通过转染实验和构建异种移植小鼠肿瘤模型，发现下调YAP抑制了lnc-CTHCC诱导的肝癌细胞在体外和体内的增殖、迁移和侵袭增加。YAP过表达则补救了lnc-CTHCC基因敲除对细胞增殖、转移和EMT的影响。
综上所述，这些数据表明，lnc-CTHCC依赖于YAP基因促进肝癌恶化。
图7
为了确定lnc-CTHCC在肝癌中的上调是否与m6A修饰有关，作者用抗m6A抗体进行了RIP-qPCR实验，发现m6A在肝癌细胞的lnc-CTHCC基因中显著富集。敲除m6A甲基转移酶（METTL3）基因后，肝癌细胞中的lnc-CTHCC表达降低，并抑制了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。并且，在METTL3过表达的细胞中敲除lnc-CTHCC显著降低了增殖和侵袭能力，这表明lnc-CTHCC在肝癌细胞中介导了METTL3的功能。
最后，作者通过MS分析在lnc-CTHCC的pull-down实验结果中鉴定出两个已知的识别m6A修饰位点的基因（IGF2BP1和IGF2BP3），WB分析进一步证实lnc-CTHCC与IGF2BP1和IGF2BP3结合，RIP分析表明IGF2BP1和IGF2BP3显著富集了lnc-CTHCC。并且敲除这两个基因能够降低肝癌细胞中lnc-CTHCC的表达水平，并抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。
综上所述，该研究表明，lnc-CTHCC是一种在睾丸和肝癌细胞中高表达的高度保守的CT-lncRNA，对肝癌发生和发展起促进作用。分子机制上，METTL3介导和IGF2BP1/IGF2BP3识别的m6A修饰增加了lnc-CTHCC在肝癌细胞中的表达，lnc-CTHCC通过将hnRNP K连接到YAP1启动子从而激活其功能。因此lnc-CTHCC在致癌的METTL3-IGF2BP1/IGF2BP3-lnc-CTHCC-hnRNP K-YAP轴中起到促进肝癌发生和发展的关键作用，表明lnc-CTHCC可能成为肝癌个体潜在的预后指标和治疗靶点。
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