核酸提取磁珠简介及注意事项 |实验技术专栏
传统的生物、医学和农学类实验室经常会进行核酸相关的分子生物学实验，常用到的核酸提取纯化方法为离心过柱法，虽然纯度比较高，但操作繁琐，提取过程中需要不断重复开盖、加漂洗液和离心等步骤，每次处理的样本数量相当有限，提取效率较低。
为了适应现代分子生物学检测实验高通量、高灵敏度、自动化操作的需要，磁珠法应运而生。
磁珠的发明构想最初来自挪威科技大学的化学家John Ugelstad，他在1979年以聚苯乙烯为材料，制造出均匀磁化的球体微粒。而第一个利用磁珠法提取核酸并且申请专利的商品化试剂出现在1998年。随着近些年的不断优化和发展，市面上出现了适用于各种核酸纯化场景的磁珠，而且磁珠的粒径也已经达到了纳米级别。
一、什么是磁珠
生物磁珠是指表面修饰有不同基团的超顺磁性微粒。一般有以下几个特点：
超强的顺磁性。在磁场中能够迅速聚集，磁场消失后，在外力作用下又能均匀的分散。
较小的粒径。在溶液中不会快速沉降，发挥作用时间较长。
表面具有丰富的基团。不同的基团利用不同的作用力抓取目的核酸。根据这些特点，我们即可得出磁珠的作用过程：以表面基团抓取核酸，核酸被固定在磁珠表面，在磁场的作用下，核酸随着磁珠被聚集，最后再用一定的方式将核酸洗脱下来。
磁珠法核酸提取流程图
二、磁珠的组成与结构
磁珠的组成成分主要有内层的高分子材料、中间层的金属氧化物和外层的功能基团。内层常用的高分子材料有聚苯乙烯、聚氯乙烯和聚乙烯亚胺，中间层的金属氧化物主要是Fe3O4、外层的基团主要有羟基、羧基、氨基等。随着磁珠不断的优化和发展，目前主流的磁珠结构为，内层为聚苯乙烯、中间层为Fe3O4，外层为功能基团，其中功能基团固定在SiO2上。
磁珠结构示意图
虽然磁珠外层的基团类型比较多，但是对于核酸提取纯化来说，效果较好的基团为羟基和羧基。下面重点介绍这两种磁珠的工作原理以及各自的特性。
三、硅羟基磁珠
硅羟基磁珠一般称之为硅基磁珠，硅基磁珠吸附核酸分子主要是依靠氢键和范德华力。核酸分子在水溶液中能均匀分散，是由于三种共价作用力：静电相互作用、氢键和范德华力。核酸在水溶液中通过氢键和范德华力，结合了大量的水分子在其周围，形成一个水化层，阻止核酸分子的聚集，保持分散状态。使用硅基磁珠提取核酸时，通常需要高浓度的盐溶液和一定比例的醇溶液（比如乙醇和异丙醇），因为醇溶液可以起到疏水作用，高浓度的盐离子可以破坏核酸分子表面的水化层，促进磁珠表面与核酸分子以氢键、范德华力和静电作用进行吸附。通过外加磁场，对核酸进行收集。洗脱时，盐离子和醇溶液被去除，加入的水溶液会重新水化核酸分子，核酸分子和磁珠共存在溶液中，再利用磁场将磁珠富集，核酸存在上清水溶液中。由于硅基磁珠的这种特性，在使用硅基磁珠提取核酸时，洗脱需要一定的温度，高温可以破坏这种氢键和静电作用，进一步提高核酸的得率。
四、羧基磁珠
羧基磁珠除了拥有和硅基磁珠相似的吸附核酸方式外，还有一种独特的与核酸分子结合的机制。羧基磁珠在使用时，反应体系里会加入一定浓度的PEG（聚乙二醇）和盐离子。核酸在一定浓度PEG存在的条件下，PEG会“夺走”核酸分子旁边的水，分子构象会发生变化，核酸分子被“挤压”，暴露出磷酸骨架上大量的带负电的磷酸基团。带负电的磷酸基团借由溶液中的Na+与羧基形成离子桥，使核酸被特异性的吸附到羧基磁珠表面。洗脱原理与硅基磁珠类似，PEG和盐离子被去除，核酸分子恢复构象，然后被洗脱下来。
羧基磁珠吸附核酸示意图
核酸这种构象的改变，与片段长短也有一定关系。核酸片段越长，表面裸露的带负电的磷酸基团越多，更容易吸附到磁珠，只需要较低浓度的PEG和Na+就能有较高的得率。核酸片段越短，则需要更高浓度的PEG和Na+将其表面的水化层破坏，以裸露出较多带负电的磷酸基团，以便于磁珠吸附。利用这一特性，通过调节磁珠工作液（PEG和Na+）与核酸样本的体积比，则可以达到片段筛选的目的。而硅基磁珠则没有此效应。值得注意的是，片段筛选只能用于双链DNA，因为RNA和单链DNA二级结构比较复杂，片段长度与裸露的磷酸基团相关性不强，无法像DNA那样进行片段筛选。
羧基磁珠片段筛选示意图
五、注意事项
磁珠的样本选择性
磁珠的种类多种多样，无论是表面基团、粒径大小，还是内核成分，都会影响磁珠的特性。不同类型的磁珠可适配不同的样本。对于不同的样本类型，相同磁珠的抓取效率也不尽相同，因为在磁珠抓取之前，不同样本的裂解液里的成分和杂质不同，都会影响磁珠的抓取效率。所以，不能用一种体系去适配所有类型的样本。当改变样本类型后，吸附效率降低，可先通过调整磁珠工作液与核酸样本的体积比，再考虑磁珠的更换。
磁珠不一定需要低温储存
不同磁珠的特性不同，有的磁珠用完后需要立即放入低温环境中，以保证其吸附效率。而有的磁珠室温即可长时间储存，温度波动反而会影响其吸附效率。所以不同磁珠需要根据产品说明选择不同的储存方式。
磁珠越多，提取效果不一定越好
磁珠和液体的比例是有一定得阈值的，磁珠过多，导致其分散性不好，降低其与核酸的接触，以至于吸附效率降低。此外，磁珠过多也会吸附更多的杂质，这些杂质会与磁珠紧密结合，增加清洗难度，最后洗脱得到的核酸纯度会降低，影响后续实验。
取样量越多，提取效果不一定越好
取样量较多，首先会影响裂解液的裂解效率，其次较多的取样量会引入较多的杂质，降低磁珠的吸附效率，以至于降低产物的浓度和纯度。
洗涤次数越多，产物纯度不一定越高
虽然洗涤会去除一定的杂质，但是也会损失一定量的核酸。所以洗涤次数不可过多，一般不超过三次。如果洗涤三次，产物里面还有杂质，说明前期引入的杂质就比较多，光靠洗涤是不能完全去除杂质的，要在洗涤之前就需要想办法降低杂质的含量。
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