详解组织保存液成分和作用，还不来围观？|单细胞专题

一、背景介绍


选择样本保存方法需要考虑几个原则：①高保真度；②少背景噪音；③可标准化。临床上的一般技术，包括超低温保存法、化学固定法等都不是非常理想的方式。研究表明，这样的保存方式会造成组织细胞核酸的降解，传统的冻存样本会造成转录组的完整性和细胞群类异质性的降低。如甲醇固定的样本，固定和水合过程细胞难免出现破裂，导致背景增高，游离RNA污染程度增加。超低温冷冻保存（-80℃）的组织在冻存和复苏的过程中，会造成大量的细胞损伤，通常只能抽核研究核的信息。因此，目前单细胞中常用的方式是采用组织保存液储存样本，低温保存寄送的方式，既可以保持样本最原始组织活性状态，又可以解决样本难以获取以及批次性效应等问题。低温条件下（0-6℃），保存在适当的保存液中可以达到保持组织细胞活性、降低细胞新陈代谢，保持基因表达稳定的效果。合适的保存液在低温下应该具备以下功能：1.维持细胞的活性，减少细胞死亡或者程序性凋亡；2..固定细胞的状态（减少细胞生物进程）；3.在植入后能够发挥器官（组织/细胞）原有的功能；4.延长体外保存时间；5.保存条件简便。目前对于细胞的保存可以实现在适当的保存液中超低温冻存或低温保存等。但组织的细胞成分复杂，是由多种类型细胞构成。组织的保存液需要对多种不同类型的原代细胞都具有较好的保存效果。并且由于组织结构紧密，保存介质不易渗透到组织的细胞中，因此保存液需要有一定的组织渗透性。而在提高保存介质组织渗透性的同时，又不能破坏组织的空间结构和形态，所以相比细胞的保存，实现组织的保存难度更大。最开始的组织保存液主要是用于器官移植，使用的方案主要有：the Stanford University solution（斯坦福大学方案） （1988）、 a modified Collins solution（改进的柯林斯方案） （1990）、the University of Wisconsin solution（UW，威斯康辛大学方案）（1989），其中，威斯康辛大学（UW）方案被认为是器官保存解决方案的行业标准，逐渐取代了前两种，但它提供的保存时间有限，部分产品仅最长达125min。器官移植使用的保存液等对于组织的保存时间较短；同时器官保存液中包含激素成分，例如地塞米松、前列腺素等会对保存的组织细胞产生刺激，从而对组织细胞基因水平上的产生影响，造成基因表达的改变，影响下游基因检测和研究，例如严重影响单细胞转录组测序的实验结果。一些传统的组织保存试剂通过加入动物源蛋白，例如牛血清白蛋白等，都会对组织细胞的基因表达造成潜在的影响。 随着不断改进，又出现了基于HBSS的改进方案-GALA solution，HypoThermosol® FRS（HTS-FRS）以及美天旎组织保存液（MACS Tissue Storage Solution）等诸多产品。

二、组织保存液一般成分及作用


通常来说，用于新鲜组织样本的保存试剂，需要在低温条件下保持组织具有较高的细胞存活率，维持细胞基本的生理代谢，具有较高的渗透性和组织穿透能力，能适应与多组分细胞的保存，并且维持组织的空间结构形态、细胞膜稳定性，避免溶液中冰晶生产，同时不含会引起基因表达改变的成分，例如激素类成分（地塞米松、前列腺素、胰岛素）、抗生素类成分（青霉素）和动物源蛋白（牛血清白蛋白、人血清白蛋白）等，解决新鲜组织样本的保存与运输。因此，一般主要含有以下几大类成分：1）电解质平衡离子、PH缓冲液离子缓冲液成分包括氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸二氢钠、磷酸氢钾、碳酸氢钾、磷酸二氢钾、碳酸二氢钾、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三（羟甲基）氨基甲烷等中的一种或几种。溶液的pH范围在7 .0-7 .6。作用：维持组织细胞渗透压的盐离子浓度和维持生理环境pH稳定的缓冲液成分。2）能量底物（energy substrates）糖类化合物：包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、乳糖酸、棉子糖、海藻糖、麦芽糖、葡聚糖、羟乙基淀粉、水溶性淀粉等其他单糖、二糖、三糖或多糖类化合物中的一种或几种；非糖类能量物质：包括腺苷等核苷，腺苷酸等核苷酸和甘氨酸等氨基酸中的一种或几种。作用：供能量，维持组织细胞最低的生理代谢条件。3）自由基清除剂（free radical scavengers）、抗氧化剂（antioxidants）成分包括：还原型谷胱甘肽、维生素C、维生素D、水溶性维生素E、别嘌呤醇、N-乙酰半胱氨酸等一种或几种。作用：清除组织细胞代谢过程中产生的自由基，维持细胞内的氧化还原环境，防止保存过程中细胞凋亡，以及引起的细胞内核酸降解。4）渗透稳定剂（osmotic/oncotic stabilizers）成分包括：葡聚糖、羟乙基淀粉、水溶性淀粉、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种。作用：避免保存条件下的温度变化或者溶液渗透差造成的细胞膜破裂。5）其他成分：如一氧化氮合酶底物；抗凝剂等如L-精氨酸可以作为一氧化氮合酶底物，催化生成NO，该过程短期可清除自由基，对内皮细胞、巨噬细胞、神经细胞等保护作用。抗凝剂如加入肝素等，有助于防止保存器官的毛细血管的凝血，防止在微循环水平上形成血栓，以便能够进行营养传递和毒素清除。但PCR实验谨慎考虑加入肝素。

三、几种保存液品牌介绍（成分、应用优缺描述）


1）UW solution（University of Wisconsin solution）（1989）UW solution是器官移植中保存器官的金标准，在国际上被广泛应用。溶液常温储存，预冷后使用，支持肾、肝、胰腺等器官的移植前保存，植入前需要灌洗清除SPS-1溶液（含有较高钾离子，会造成心率失衡），提供的保存时间有限，部分产品仅最长达125min。主要成分为：羟乙基淀粉、乳糖酸、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、棉子糖、腺苷、别嘌醇、谷胱甘肽、氢氧化钾。其中，磷酸二氢钾、氢氧化钾可维持组织细胞渗透压和生理环境pH稳定；乳糖酸、腺苷、羟乙基淀粉可做为能量底物，其中羟乙基淀粉和乳糖酸也可做为渗透稳定剂，能减轻冷藏时细胞的肿胀；谷胱甘肽做为抗氧化剂，可以维持细胞内的氧化还原环境，防止保存过程中的细胞凋亡以及细胞内核酸降解。表1  UW溶液主要成分2）基于HBSS的改进方案-GALA solution（2011）Hank's balanced salt solution（HBSS）是集缓冲液的缓冲力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体的，具有维持渗透压、保持PH稳定以及提供简单的营养的作用，可满足体外实验中组织、器官或细胞的生存和代谢的基本需要。一些平衡盐溶液中还添加了少量酚红，用以指示溶液的酸碱度变化。The GALA solution是在HBSS基础上改进后的试剂，以谷胱甘肽、抗坏血酸、L-精氨酸命名。在HBSS基础上添加抗坏血酸（维生素C）、还原谷胱甘肽、L-精氨酸和肝素，其最终浓度分别为约500 μM、1000 μM、500 μM和50 units/ml，然后用10M氢氧化钠将pH调整到7.4。极大提高了组织保存效力和保存时间。适用器官/组织类型有心脏、冠状动脉、肺、肾脏、大脑、肌肉、皮肤、肠、骨、眼睛等或其他样品类型。其中抗坏血酸/谷胱甘肽作为细胞还原剂，可以缓解无氧或者再灌注条件下的氧化损伤；L-精氨酸可以作为一氧化氮合酶作用的底物，能够对内皮细胞、巨噬细胞、神经细胞等起到保护作用；抗凝剂有助于防止保存器官的毛细血管的凝血，防止在微循环水平上形成血栓，以便能够进行营养传递和毒素清除。上述成分组合、浓度、PH等并不是固定不变的，在实际应用中可做调整。如一些实施案例中，添加腺苷到约500-5000 μM的终浓度，作为补充能源物质；抗坏血酸的终浓度在约 25-1000 μM之间；谷胱甘肽的终浓度在约50-2000 μM之间；L-精氨酸的终浓度在约 250-2000 μM之间；肝素的终浓度在约50-250 units/ml之间；pH在7.0-7.6 之间。还有一些实施案例抗凝剂使用的是水蛭素，而非肝素。表2  Hank's balanced salt solution（HBSS）主要成分表3 不同方案保存时间细胞活性比较【来自专利】3）HypoThermosol® FRS (HTS-FRS) （品牌：BioLifeSolutions）HypoThermosol® FRS是一种优化的低温（2-8℃）保存剂，可以改善和延长细胞、组织和器官的保存，不含动物源成分、无血清、蛋白等。HypoThermosol® FRS具有独特的配方，可以解决低温保存过程中细胞的分子生物学反应，包括解决低温压力的平衡离子和分子，有针对性的pH缓冲液，以及减少毛囊细胞死亡的强效自由基清除剂。研究表明，采用HTS-FRS保存液低温保存或者运输样本时，有效的保存期窗口为72h以内，能够有效维持细胞活性、细胞异质性（亚群分类）、转录组完整性（基因覆盖度）、转录组表达稳定性。已报道的可适用HTS-FRS保存的样本类型有胰脏、心脏、毛发、皮肤、分离的血管、多种类型的肿瘤样本、筋腱、睾丸、其他组织器官等[1]。其主要成分包括在低温环境下平衡细胞内状态的关键离子，pH缓冲液，能量底物，自由基清除剂和渗透稳定剂等，具体如含蔗糖、氢氧化钠、氢氧化钾等，其余成分详细信息暂未公布。 图1 HypoThermosol® FRS保存液4）美天旎组织保存液（MACS Tissue Storage Solution）（品牌：Miltenyi）美天旎组织保存液是一款经工艺优化后的全新组织保存液，也是单细胞测序常用的组织保存液，可用于短时间内离体组织的保存/运输，该保存液是一种低温（2-8℃）保存介质，采用独特的低温保存方法来解决细胞在低温保存过程中的分子生物学反应，能有效避免实验过程中的细胞活化、凋亡、坏死等现象，降低实验背景干扰，得以改善和延长细胞、组织和器官的保存。已成功用于鼻咽癌/癌旁/淋巴；胆管；胆囊癌；主动脉；肺；肝、肝癌穿刺、脂肪肝；小鼠睾丸；股骨喉癌/淋巴/癌旁；脊柱；甲状腺/甲状旁腺；结直肠癌组织；椎间盘软骨；股骨；肾脏；皮肤等。组织保存液中含有低温状态下稳定细胞状态的关键离子以及pH缓冲液、能量代谢底物、自由基清除剂、渗透/吸胀稳定剂等，其具体成分信息未公布。美天旎组织保存液能够在2-8℃的最佳存储新鲜固体组织至少48小时。
图2 MACS Tissue Storage Solution图3 MACS 组织存储解决方案与竞争对手产品之间每克组织的细胞数比较图4 MACS 组织存储解决方案与竞争对手之间的细胞活性比较【来自官网说明】图5（示例） CT26小鼠肿瘤在MACS组织储存溶液中于4°C储存24或48小时，解离后总细胞活力【来自官网案例】

参考文献：

Wang W, et al. High fidelity hypothermic preservation of primary tissues in organ transplant preservative for single cell transcriptome analysis. BMC Genomics. 2018 Feb 13;19(1):140.

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