用户文章PJ：miR164a-NAM3诱导番茄乙烯产生介导抗寒性| 转录调控专题

论文标题：The miR164a-NAM3 module confers cold tolerance by inducing ethylene production in tomato

刊登日期：2022-06-02

发表杂志：The Plant journal:for cell and molecular biology

影响因子：7.091

研究机构：浙江大学

文献地址：10.1111/tpj.15807

前言

环境温度过低会损害植物细胞膜完整性并抑制其光合作用，从而影响植物的生长和发育。在进化过程中，植物已经进化出复杂但有效的生化和生理机制来应对冷胁迫。在冷胁迫下，下游应激相关基因会出现差异表达，而这些基因往往受到多种转录因子的共同调控。

NAC转录因子家族是植物中特有的一类转录因子，参与调控植物的生长发育、抵抗干旱、低温、高盐等胁迫损伤。有研究发现miR164可以在转录后水平上调控NAC TFs。而miR164-NAC对番茄耐寒性中的调控作用还有待研究。

近日，浙江大学周艳虹教授课题组在The Plant journal中发表了题为The miR164a-NAM3 module confers cold tolerance by inducing ethylene production in tomato的论文，揭示了miR164a-NAM3调控番茄植株耐寒性的机制。

结果


1、SlNAM3正向调控番茄的耐寒性

为了探究NAC TFs在耐寒性中的作用，将野生型番茄植株放置于在4℃环境下冷处理6h，并测定它们的NAC基因转录水平，一共测得101个NAC 基因的转录水平（图1a）。其中，14个NAC基因的转录水平在冷胁迫后增加了4倍以上。生物信息学预测显示，在这14个NAC基因中，JA2L、NAC90、NAC90like和NAM3可能分别是miR319c-3p、miR6023、miR159b-3p和miR164a/b-5p的靶基因（图1b）。

为了确定这些NAC基因在耐寒中的作用，随后通过VIGS技术在番茄植株中沉默了这4个NAC基因（图1b）。沉默后植物的表型、光系统II的最大光化学量子产能(Fv/Fm, PSII光抑制的参数)和电解质相对外渗率(REL，膜损伤的指标)并没有发生变化。

与空载体（pTRV）植株相比，在4℃环境下pTRV - NAC90like和pTRV- NAM3植株的Fv/Fm值较低，但REL和MDA值较高，其中pTRV-NAM3的变化最显著（图 1c）。而pTRV- JA2L和 pTRV- NAC90的植株的植物表型、Fv/Fm和REL方面没有显著差异。这些结果表明，NAM3是耐寒性的一个正向调节因子。

2、Sl-MIR164a和SlNAM3的相互作用

作者用多种方法定性和定量地评估了Sl-MIR164a和SlNAM3之间的直接相互作用。5’RLM-RACE检测和测序结果显示，SlNAM3的转录本在距离Sl-miR164a/b-5p的5’端第10和11个核苷酸之间被切割（图2a）。

随后作者通过分析放置在4℃环境下72h的植株中的Sl-miR164a/b-5p和SlNAM3的转录本水平，发现番茄叶片中成熟的Sl-miR164a/b-5p的转录水平在低温环境下3h内被显著抑制，随后逐渐上调。在接下来的9h里，达到了25℃时对照植株的水平（图2b）。而SlNAM3的转录水平在4℃低温下显著升高，并在冷胁迫后6 h达到最高值，随后逐渐下降(图2c)。

作者通过STTM技术生成了Sl-miR164a/b-5p沉默的番茄植株来研究Sl-miR164a/b-5p对SlNAM3转录水平的调控，与25℃下的植株相比，低温处理后STTM164a/b-5p与野生型植株的SlNAM3表达量的差异显著增加（图2d）。此外，作者通过双荧光素酶试验，检测了Sl-MIR164a对SlNAM3表达的体内调控作用。发现Sl-MIR164a与融合到SlNAM3靶点的LUC共同表达时，荧光素酶活性明显下降。然而，插入mSlNAM3序列后，荧光素酶活性无变化（图2e，f）。

随后通过荧光成像检发现除了过表达的Sl-MIR164a外，其他处理都显示有荧光素酶信号。这些结果表明，miR164a/b-5p直接靶向SlNAM3序列并抑制其表达（图2g，h）。

3、miR164a -NAM3增加了耐寒性

作者通过CRISPR/ cas9介导的基因编辑，从而得到了两个NAM3#2、NAM3 #4敲除的番茄苗和一个过表达NAM3-OE#6的番茄苗。在4℃环境下，与野生型植株相比，STTM164a/b-5p和NAM3-OE的植株表现出较少的萎蔫（图3a，d）。相比之下，NAM3敲除植株在4℃环境中表现出更多的萎蔫，Fv/Fm更低（图3d，e）。结果表明，miR164a/b-5p对番茄植株的耐寒性有负向调节作用，而SlNAM3则有正向调节作用。

为了研究miR164a/b-5p和SlNAM3在冷胁迫中的关系，通过VIGS技术在STTM164a/b-5p和野生型植株中沉默了SlNAM3，发现沉默后STTM164a/b-5p和野生型植株的萎蔫程度加剧（图3g），Fv/Fm值下降（图3h）。以上数据表明，SlNAM3在冷胁迫中作用于miR164a/b-5p的下游，并且miR164a/b-5p和NAM3可以调节番茄植株的耐寒性。

由于CBF通路在植物对冷胁迫的响应中发挥着重要作用，作者通过EMSA实验和双荧光素酶试验发现SlNAM3-OE和野生型植株在SlCBF1、2、3的转录水平上没有明显差异。

作者还发现COR47like转录水平在STTM164a/b-5p和SlNAM3过表达植株中显著升高，而在NAM3敲除的植株中有所降低（图3c，3f）。与空载体植物(pTRV)相比，沉默SlNAM3后STTM164a/b-5p和野生型植株中COR47like的表达都降低了（图3i）。这些结果表明，miR164a -NAM3调控番茄的COR47like转录本和耐寒性，但不直接调控CBF通路。

4、乙烯参与了miR164a-NAM3调控的耐寒性

有研究发现，乙烯参与调节植物对多种应激的调控。随后作者检测了低温环境下番茄叶片的乙烯产量。发现乙烯释放量在冷胁迫下显著增加，在4℃环境下12 h达到峰值，这与SlNAM3基因表达上调趋势一致（图2c）。为了进一步探索miR164a/b-5p和SlNAM3表达水平的改变对乙烯合成的影响，作者分析了低温环境下，STTM164a/b-5p、SlNAM3- OE、NAM3敲除和野生型植株叶片内源乙烯水平、乙烯前体1-氨基环丙烷羧酸（ACC）含量以及ACC合成酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）活性的变化。发现与野生型植株相比，STTM164a/b5p（图4a-d）和SlNAM3-OE植株的乙烯产量、ACC含量增加以及ACS和ACO活性更高，而在NAM3敲除的植株中这些参数显著降低(图4e-h)。这些结果表明，在冷胁迫下，miR164a/b-5p负向调控番茄乙烯产生，而SlNAM3则正向调控。

为了进一步探索乙烯在耐寒性中的作用，作者首先找到了ACC处理的最适浓度，接下来，在冷胁迫前施用10 μm ACC到NAM3敲除和野生的植株上，发现ACC显著缓解NAM3敲除和野生型植株的萎蔫，增加Fv/Fm值和COR47like转录本水平（图5a-c）。这些结果表明，NAM3通过乙烯依赖途径调控番茄植株的耐寒性。

为了验证miR164a/b-5p -NAM3是否通过影响乙烯合成相关基因的转录来调控乙烯的产生，测定了番茄叶片中9个ACS基因和6个ACO基因在低温胁迫下的转录水平。其中，番茄植株在4℃条件下放置6h后，SlACS1A/B、SlACS6、SlACO1和SlACO4的转录水平显著升高（图6a）。

然后，我们使用VIGS技术对SlACS1A/B、SlACO1和SlACO4进行沉默，使SlACS1A/B、SlACO1和SlACO4的转录水平降低了60-70%（图6b）。在4℃环境下，与空载体植物相比，三株敲低的植株明显萎蔫，Fv/Fm和COR47like的表达量显著降低，REL增加（图6c，d）。

并且在STTM164a/b-5p和SlNAM3-OE植株中，SlACS1A/B、SlACO1和SlACO4的转录水平显著升高(图7a-c)，在低温环境下，NAM3敲除的植株中与野生型植株相比，SlACS1A/B、SlACO1和SlACO4的转录水平明显降低（图7d-f）。

综上所述，乙烯合成相关基因SlACS1A/B、SlACO1和SlACO4参与了番茄低温胁迫下的耐寒性，且miR164a/b-5p负向调控这些基因的转录，而SlNAM3正向调控这些基因的转录。

5、NAM3直接与SlACS1A，SlACS1B，SlACO1和SlACO4的启动子结合并促进其表达

在对SlACS1A、SlACS1B、SlACO1和SlACO4的启动子序列进行分析时，作者发现了了CACG基序的存在。随后通过EMSA试验研究发现NAM3直接结合在SlACS1A、SlACS1B、SlACO1和SlACO4启动子的CACG基序上，但CACG突变到AAAA时，NAM3则无法与这些突变位点结合（图8a-d）。

通过ChIP-qPCR进行体内分析发现与野生型植物相比，SlACS1A、SlACS1B、SlACO1 和 SlACO4 启动子片段显著增加（图 8e）。为了进一步确认 NAM3 是否是SlACS1A、SlACS1B、SlACO1和SlACO4的转录激活因子，于是又进行了双荧光素酶测定，发现NAM3显示显著激活SlACS1A、SlACS1B、SlACO1和SlACO4 基因的启动子（图8f）。结果显示，SlNAM3可以在体外和体内直接与SlACS1A、SlACS1B、SlACO1和SlACO4的启动子结合，并促进它们的表达。

总结

本研究通过RNA测序发现miR164a/b-5p -NAM3通过影响乙烯的产生从而调控番茄的耐寒性。同时对后续研究植物耐寒性提供了重要依据。

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