PBJ：单细胞转录组图谱揭示茶叶中酯型儿茶素发育轨迹和新的代谢途径 | 单细胞专题

论文标题：Single-cell transcriptome atlas reveals developmental trajectories and a novel metabolic pathway of catechin esters in tea leaves

刊登日期：2022年07月

发表杂志：Plant Biotechnology Journal

影响因子：13.263

研究机构：安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室

技术手段：单细胞转录组测序，联川生物OmicStudio云平台——“联川星云（SCI）”

文章结构

主要研究内容

1. 茶叶结构及细胞类型鉴定Single-cell

图1

茶树是一种重要的木本饮料经济作物，茶叶的独特味道主要由酯型儿茶素引起，但它们在不同细胞类型中的确切形成机制尚不清楚。由于茶树叶片细胞壁厚，次生代谢丰富，生长周期长，并且作为木本植物组织难以被消化释放原生质体，因此茶叶各细胞类型的特异性标记基因很少，增加了茶叶细胞类型鉴定的难度。

为了攻克这些困难，作者首先用不同方法检测了茶叶切片结构，观察茶叶细胞。在可见光显微镜下观察到各类上表皮细胞、下表皮细胞、叶肉细胞和维管束细胞（图1a-d）。发现只有下表皮有气孔和腺毛。并在第1叶（1L）观察到高密度腺毛和低密度气孔，第3叶（3L）相反(图1e, f）。1 L中的茶氨酸，儿茶素和咖啡因含量均高于3L（图1g）。此外，由于毛状体细胞和石细胞体积普遍较大，在单细胞测序之前会被过滤并通过40μm筛去除，因此并不会在scRNA-seq中鉴定到，这也为细胞鉴定提供了直观的基础（图1h）。

2. scRNA-seq及茶叶细胞图谱构建Single-cell

图2茶树嫩叶scRNA-seq简要流程图

图3 茶树嫩叶细胞图谱（该分析内容和图片可以通过“联川星云（SCI）”实现）

作者根据观察到的茶叶微观特征，建立了茶叶原生质体快速分离方法（添加蜗牛酶将消化时间从16h缩短到4-6h），细胞活率为73%-82%，每克样本大约能分离到3.5-6.6×10⁶个原生质体。在此基础上，通过对16977个单细胞转录组进行测序，通过PCA分析和SNN聚类分析将茶叶单细胞划分为16个细胞簇（图2, 图3a, b）。随后作者构建了单细胞tSNE图，揭示了细胞群体的局部相似性和全局结构（图3c）。每个簇中有91个独特的CSG以dot plot图显示，包括拟南芥标记基因的12个同源基因（图3d）。

图4

随后，作者又通过相同的酶解手段，对叶片上表皮、下表皮、主脉木质部等6个亚组分进行了分离（图4b）。并利用qPCR技术验证各细胞簇特异高表达的基因在6个组分中的相对表达水平，最终鉴定到79个有效基因。结合模式植物中的细胞标记基因同源注释，包含了茶树叶片中的6个主要细胞类型（图4a）。作者选择每个组织中的3个标记基因构建tSNE图，显示了细胞表达分布情况，并发现表皮标记基因的表达模式与tSNE结果最吻合（图4c）。作者还基于簇特异性基因（CSGs）对每个簇进行定义，结果表明单细胞转录组图谱可以识别茶叶的大多数主要细胞类型。

3. 茶树嫩叶分化轨迹Single-cell

图5 茶树嫩叶分化轨迹（该分析内容和图片可以通过“联川星云（SCI）”实现）

接下来，作者绘制了茶树嫩叶细胞的分化和发育轨迹。基于样本生物学意义将早期分化细胞设为初始点，拟时间轨迹共有4个分支，将所有细胞分成了9种状态（图5a-d）。随后标注了各个状态和分支的高表达基因，前50个高表达基因主要与苯丙类化合物和类黄酮生物合成相关（图5e）。BEAM（分支表达式分析建模）分析结果提供了一个显著变化的基因列表，在4个分支中共表达了8个基因，包括参与角质生物合成，植物表皮形态发生，蜡和木栓质生物合成以及未表征蛋白的基因（图5f-j）。图5k展示了茶树嫩叶细胞的命运决定简图。

4. 次级代谢物生物合成相关基因的细胞特异性分布Single-cell

图6

作者进一步分析发现，与黄酮类化合物、咖啡因和茶氨酸生物合成相关的基因在1L和3L的不同细胞类型中均显示出细胞特异性（图6a, b）。茶树叶片中富含木质素，其生物合成相关基因与类黄酮生物合成共享上游底物，多种酶的高表达改善了特定细胞类型的机械强度。这些结果表明木质素生物合成相关基因的表达在发育过程中的不同细胞类型中具有时空特异性。

5. 新的酯型儿茶素糖基转移酶Single-cell

图7

基于单细胞转录组数据和细胞类型的鉴定，能够降低不相关细胞带来的背景噪声，从而提高调控网络的预测精度。于是作者通过叶肉细胞中的特异表达矩阵进行共表达网络分析，发现了一个在叶肉细胞中高表达并与儿茶素代谢显著相关的糖基转移酶基因UGT72B23。通过体内外活性测定，验证了其酯型儿茶素糖基转移酶活性。出乎意料的是，重组UGT72B23能够以表没食子儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)为底物，特异性催化酯型儿茶素糖苷的形成(图7a)。通过在烟叶中瞬时过表达或利用反义寡核苷酸抑制该基因，检测到ECG糖苷含量显著增加或显著降低，并未检测到EGCG糖苷（图7f-j）。在茶树的5种组织中也发现该基因的表达与ECG糖苷含量相关（图7k, l）。最后，作者绘制了单细胞水平下UGT72B23介导的时空特异性的酯型儿茶素葡萄糖苷合成途径，反映了植物中酯型儿茶素代谢的复杂性。

图8

总结

该研究采用的原生质体快速分离技术为其他木质化组织快速分离提供了新思路。此外，其采用多种方法对细胞标记基因进行了验证，并绘制了茶树叶片发育轨迹，为木本植物叶片细胞图谱绘制提供了重要的参考信息。通过筛选特定细胞类型，构建特异表达矩阵，发现了一种新的酯型儿茶素糖基转移酶，提供了茶树酯型儿茶素糖苷化证据。

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