【软件解读】深度清洗单细胞转录组数据的新方法

大家好，这里是哲哲的软件小金矿。今天给大家介绍一款scRNA-Seq数据清洗软件——AutoClass。该软件于2022年4月发表于Nature Communications。其基于深度神经网络，对scRNA-Seq数据存在的噪声、技术误差、假零表达和dropout等现象进行清洗或填补，而且由于未对数据作任何分布上的假设，具有通用性。同时，在一定程度上还能帮助发现潜在的差异基因、去除批次效应。接下来，我们一起详细了解这款软件吧~

0 背景

scRNA-Seq作为具有超高分辨率和超高通量的转录组分析技术，在产生大量数据的同时，也对数据分析带来了巨大挑战。一方面是RNA扩增、测序、比对等过程带来的偏差。另一方面，极小的样本量和低RNA捕获率会导致大量假零表达和dropout。还有批次效应对基因表达谱造成的复杂影响。

目前大多数scRNA-Seq去噪方法都基于特定分布假设，如DCA和SAVER都基于负二项分布，sclmpute基于高斯和伽马混合模型。但目前scRNA-Seq数据的分布还未达成共识，阻碍了数据的准确分析和解释，故作者开发了一种基于神经网络、无分布假设的scRNA-Seq数据清洗方法——AutoClass。

1 软件组成

AutoClass是一个复合深度神经网络，集成了两个神经网络组件——一个自动编码器和一个分类器（图1a）。自动编码器能够实现输入数据的压缩与重建，其作为无监督方法，不假定数据分布，故具有纠正宽范围噪声和非信号变化的潜力。加入分类器后则能更有针对性地滤除噪声并保留信号（图1b）。需要说明的是，分类器虽然会对数据进行预聚类，赋予虚拟的类别标签，但是聚类基于数据本身特征，而标签也不是已知的细胞类型，即非人为定义分类。

图1 a. AutoClass的组成；b.分类器大幅度提高了结果的准确性

2 数据清洗效果——基因表达谱恢复

作者用Splatter生成了五组细胞（1000个基因，共500个细胞），并模拟了dropout和常见的五种不同分布（随机均匀分布、高斯分布、伽马分布、泊松分布和负二项分布）的噪声。使用总共7个数据集进行测试后发现，相较于其他同类软件，AutoClass均能很好地恢复原始细胞分布（图2a-c、图3）。且平均轮廓宽度（average Silhouette width, ASW）、均方误差（mean squared error, MSE）均是最接近真实情况（图2d,e），对dropout的填补也最为平衡（图2f）。

图2五款软件的去噪效果。a-c, 分别是添加了dropout、高斯分布和负二项分布噪声的数据集。d, 平均轮廓宽度。e, 均方误差。f, dropout的填补情况。

图3 五款软件对另外三个数据集（第一到第三行，分别添加了随机分布、伽马分布、泊松分布噪声）的去噪效果

3 对差异表达分析的影响

作者重新模拟了新的数据集（分两组，有1000个基因，共500个细胞，已知161个差异表达基因），使用t-statistics中值、ROC曲线、曲线下面积（AUC）评估五款软件对差异表达分析的影响，AutoClass的结果依然最接近真实情况（图4）。

图4 五款去噪软件对差异表达分析结果的影响。a,b 真差异表达基因的t-statistics和中值。c,d ROC曲线和曲线下面积。

4 对聚类分析的影响

作者使用Buettner（182 个细胞）、Usoskin（622 个细胞）、Lake（8592 个细胞）和Zeisel（3005 个细胞）四个数据集进行测试，并用兰德指数 (Rand index, ARI)、杰卡德指数 (Jaccard Index, JI)、标准化互信息 (normalized mutual information, NMI) 和纯度评分 (purity score, PS)进行评估。结果表明，AutoClass在三个数据集中具有最好的聚类结果，另外一个数据集的聚类结果也接近最好（表1）。而且对于Usoskin数据集，AutoClass清洗后，细胞的分群与聚类效果最好，且在组内和组间的相关性是最平衡的（图5）。

表1 五款软件的聚类效果评估

图5 a, 五款软件对Usoskin数据集清洗后的聚类效果。b, 细胞组内和组间相关性

5 去除批次效应

作者使用Villani 数据集（人，血液，DC细胞，2批，共768个细胞）和ASW、ARI、NMI、PS四个指标测试批次效应去除效果。AutoClass的结果依然优于其他软件（图6）。

图6 a, 五款软件对Villani数据集清洗后的聚类效果。b, 细胞类型分离（X轴）和批次效应去除（Y轴）效果评估，分数越高越好

6 主要超参数的稳定性评估

AutoClass的主要超参数为瓶颈层大小n、预聚类数k和分类器权重w，这三个参数在较大范围内变化时，结果均较稳定（图7-9）。

图7 瓶颈层大小n、预聚类数k对AutoClass（a）和DCA（b）聚类结果的影响。

图8 AutoClass预聚类数k对t-SNE图的影响。

图9 AutoClass分类器权重w对t-SNE图的影响。

7 数据规模与运行时间

AutoClass可在普通笔记本电脑上运行，且速度很快——测试时20s处理1000个细胞，119s处理8000个细胞，706s处理32000个细胞，运行时间与细胞数量几乎呈线性关系（图10）。

图10 不同去噪方法的细胞数量与运行时间

8 提高特征量与细胞数的影响

作者在Tian数据集中分别添加了dropout和负二项式分布的噪声，并分别使用1000个和5000个高变基因（特征量）进行清洗，发现增大特征量后AutoClass的性能反而有所提升（图11）。而在高细胞数（10000个）和高特征量（10000个）的两个数据集中，AutoClass的表现同样稳定且优于其他软件（图12）。

图11 每行代表不同噪声类型和特征（基因）数量

图12 三款软件对高细胞数、高特征量的两个数据集的去噪效果

(总结)

由于使用了无监督或自监督的复合深度神经网络，加上无分布假设，使得AutoClass具有较高的通用性和稳定性。以上与其他软件的比较，以及诸多数据集的测试、聚类、差异分析等结果都很好地证明了AutoClass的强大。超参数的影响较小也侧面体现了算法本身的稳健。整体上看，AutoClass是个很有潜力的scRNA-seq数据清洗软件。

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