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Illumina文库制备试剂盒的DNA/RNA分离注意事项
各种类型样本的DNA和RNA的提取分离方法都可能引入酶促反应抑制剂。抑制剂如果去除不当，会对许多类型的酶促反应产生负面影响，包括逆转录（reverse transcription）、末端修复（end repair）、3' 末端加“A” （A-tailing）、片段化（adapter ligation）和PCR等反应。本文概述了在使用Illumina文库制备试剂盒建构文库之前分离和纯化DNA以及RNA的重要注意事项。
哪些抑制剂值得关注？
一些抑制剂或污染物是样本类型或样本源固有的，如血液中的血红蛋白或植物样本中的腐殖质/黄腐酸。其他的抑制剂或者污染物是在样品处理或提取过程中混入的，如EDTA、肝素、苯酚或氯仿。抑制剂会干扰酶与目标底物的结合（即蛋白质包覆DNA/RNA从而阻止其与酶的结合），降低酶的功能，或将酶变性失去功能（如蛋白酶、洗涤剂、苯酚和pH值）。
防止酶抑制污染或样本性能受损的最佳方法是将细致的样品处理操作与优化过的提取方案相结合，以有效纯化得到无抑制剂的核酸。洗脱或重悬核酸后样本的最终pH值应在7.0-8.5范围内。
Illumina推荐使用紫外分光光度法进行纯度评估，并使用基于荧光法的方法（如Qubit或Pico/RiboGreen）进行核酸定量。评估溶液中核酸纯度最常用的方法是通过紫外分光光度法测定260/280nm和260/230 nm比值：
采用不同的样品处理/提取方法可能会混入什么抑制剂？
如何去除DNA/RNA样品中的污染物？
如果样品中含有影响下游酶促反应的污染物，则额外的纯化步骤（如过滤纯化的离心柱再纯化）可能有助于去除污染物或提高样品的浓度。 请注意，该列表不包括所有可能的酶促反应抑制剂，而是在样品来源或样品处理/提取方法中的最常见的污染物。
文章转自Illumina官网，点击左下角“阅读原文”即可跳转原文
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