【用户文章】Nature Communications：单细胞免疫组测序解码胸腺上皮肿瘤免疫景观（文末有彩蛋） | 单细胞专题
期刊名称：Nature Communications
影响因子：17.694
发表时间：2022
发表单位：浙江大学医学院附属第二医院（伍品/柴莹老师团队）
所用组学：Single cell RNA-seq
今天这篇文章作者通过单细胞免疫组测序技术绘制了人胸腺上皮肿瘤的细胞图谱，并基于肿瘤微环境内免疫细胞构成的差异，提出了一种全新的胸腺上皮肿瘤免疫分型体系，最后通过单细胞免疫组揭示了差异性上皮细胞的起源是造成不同类型胸腺上皮肿瘤的差异性免疫微环境形成的主要原因。本文是由浙江大学医学院附属第二医院伍品/柴莹老师团队发表，下面是对本文的详细解读。
一、背景介绍
胸腺上皮肿瘤（TET），包括胸腺瘤和胸腺癌，是人类前纵隔中常见的原发性肿瘤。由于缺乏相关的细胞系和动物模型，对TETs的病因和生物学的了解还远远不够。在最新的临床指南中，因为以前定义为良性肿瘤在临床上也表现出侵袭性，因此所有类型的TET都被认为是潜在的恶性肿瘤。这表明需要进一步了解这些异质性恶性肿瘤的生物学特征。
TETs被认为是由胸腺上皮细胞（TEC）转化而来。TECs有两种主要亚型：皮层TECs （cTEC）和髓质TECs（mTEC）分别位于胸腺皮层和髓质结构中。结果表明，在胸腺T细胞发育过程中，cTECs对T细胞的正向选择至关重要，而mTECs主要参与建立中枢自我耐受的负向选择。临床研究表明，B型胸腺瘤（可能源于mTECs）患者的自身免疫性疾病发生率高于A型和C型胸腺瘤患者。这一证据表明，肿瘤细胞对人类TETs中T细胞发育的影响可能是不同的。最近，新兴的分子分类在分子水平上为TETs患者的预后和治疗分层提供了见解
本研究采用细胞计数、单细胞测序、TCR测序、组织学分析、FCM检测和免疫荧光检测等方法，对人上皮TETs起源及其对免疫细胞组成的影响进行了综合研究。基于肿瘤细胞的表型、肿瘤的免疫环境、肿瘤内T细胞发育模式和TCR库，作者确定了三种主要的人类TETs类型，并揭示了导致每种肿瘤类型中T细胞分化发育的潜在机制。
二、结果
1、人TETs的免疫环境具有异质性
作者采用多种方法对人类TETs的免疫微环境进行了全面研究（图1a）。首先，作者建立了一个40多个标记的panel，通过CyTOF检测人胸腺和TETs的细胞组成，发现肿瘤和胸腺之间有显著性差异。在人类TETs样本之间也存在一个明显的免疫景观差异，且权威分类也不完全一致。根据细胞组成的相似性，作者将人类TETs样本分为三种类型（类型1、2和3）（图1b）。但该分类方法中不同类型之间的免疫景观差异与WHO分类和Masaoka阶段也不完全一致（图1b）。通过多种聚类方法和组织学分析，进一步验证了作者分类方法的可靠性。统计分析也表明作者分类方法中大簇细胞的数量在组间有显著差异（图1c）。此外，根据WHO亚型和Masaoka分期，作者分类方法中的每种肿瘤类型都包含异质性样本（图1e、f）。
通过细胞注释，作者发现在TETs中，CD45+免疫细胞是主要的细胞亚群（图1g），且其构成了作者备选分类、WHO分类和Masaoka分期分组样本的主要变量（图1b）。进一步的细胞注释显示，TETs和正常胸腺都包含主要的免疫谱系，有丰富的CD3-CD4+CD8+和CD3+ T细胞（图1h）。组间分析显示肿瘤免疫细胞组成有明显差异，特别是参与胸内T细胞发育的CD3-CD4+CD8+和CD3+ T淋巴细胞（图1j、k）。其中，CD3-CD4+CD8+淋巴细胞比例在1型中最高，在3型中最低（图1k）。此外，从1型到3型TETs中CD3- CD4+ CD8+淋巴细胞丰度有明显降低的趋势（图1k）。但2型和3型TETs组织中CD3+ T细胞的比例均高于1型TETs（图1k）。B细胞、树突状细胞(DC)、粒细胞和NK细胞在肿瘤中的比例以1型TETs最低，3型TETs最高，从1型到3型TETs有逐渐增加的趋势（图1k）。3型肿瘤中单核细胞丰富。有趣的是，除CD3-CD4+CD8+淋巴细胞外，其他与肿瘤外周免疫反应相关的免疫细胞在3型TETs中更为丰富（图1k）。FACS进一步验证CD3-CD4+CD8+淋巴细胞与CD3+T细胞肿瘤类型的差异（图1l）。与WHO分类和Masaoka分期系统相比，作者系统且全面地关注了肿瘤中免疫细胞亚群的差异。
图1.人胸腺上皮肿瘤免疫全景图谱的异质性
Tips：上图可通过联川星云进行绘制
2、人TETs的瘤内T细胞发育模式
肿瘤间CD3-CD4+CD8+和CD3+ T淋巴细胞比例的差异揭示不同TET类型的T细胞发育模式不同。为了进一步研究TETs中T细胞发育的变化，作者使用与胸腺中T细胞发育高度相关的标记物来注释肿瘤和正常胸腺中的CD3+ T细胞亚群（图2a）。参与胸腺T细胞发育的主要T细胞亚群包括双阴性(DN, CD4-CD8-)、双阳性(DP, CD4+CD8+)、CD4+单阳性(CD4+ SP)、CD8+单阳性(CD8+ SP)和FOXP3+调节性T（Treg）细胞（图2a）。在作者的分类方法中，未成熟的DP细胞在1型TETs中占优势，而成熟的SP细胞在2型和3型肿瘤中占优势（图2f、g）。DN和DP细胞的比例在1型肿瘤中最高，在3型肿瘤中最低（图2g）。有趣的是，DN和DP细胞在TETs中所占的比例，尤其是DP细胞，从1型到3型TETs有下降的趋势（图2g）。CD4+和CD8+ T细胞的比例在1型肿瘤中最低，在3型肿瘤中最高（图2g）。此外，肿瘤中CD4+和CD8+ T细胞的比例在1型至3型TETs中呈增加趋势，而在DN和DP细胞中则相反（图2g）。FACS检测进一步证实了不同TET类型中DN、DP和SP细胞的比例（图2h）。此外，免疫荧光染色显示，DP和SP细胞分别位于2型TETs的皮质样结构和髓样结构；然而，在1型和3型TETs中未观察到典型的皮层和髓质样结构（图2i）。
成熟T细胞中，naïve SP细胞和记忆SP细胞比例在1型TETs中最低，在2型TETs中最高（图2g）。通常存在于外周组织的组织驻留CD4+ T （CD4+ TRM）细胞、组织驻留CD8+ T（CD8+ TRM）细胞和调节性T细胞（Treg）在3型TETs中呈增加趋势。此外，作者发现CD4+与CD8+ T细胞的比值在1型肿瘤中最低。同时，基于组织病理学和形态学的WHO分型和Masaoka分期系统中成熟T细胞组成的差异与作者分类分型相似。综上所述，这些发现揭示了每种类型肿瘤中T细胞发育的独特模式。
图2.胸腺中的T细胞亚群和TET亚型
Tips：上图可通过联川星云进行绘制
3、人TETs中T细胞发育障碍
为了验证不同肿瘤类型之间免疫细胞组成的差异，作者对6个配对肿瘤样本进行了scRNA-seq和TCRαβ谱分析，验证作者分类方法中的免疫亚型（图1a）。使用已知的谱系标记，进一步将细胞群注释为九种主要的细胞类型。与CyTOF结果一致的是，细胞图谱显示T细胞是肿瘤与正常组织以及TETs类型之间主要差异的细胞类型。此外，B细胞和单核细胞的比例在不同肿瘤类型中也有相似的变化趋势。
为了进一步研究不同肿瘤类型间T细胞发育模式的差异，作者将T细胞重新聚集成18个细胞簇（图3a）。然后，根据与T细胞发育相关的标记对细胞簇进行进一步注释（图3a、b）。此外，根据之前的研究，利用MKI67和CDK1鉴定了肿瘤中的两个未成熟T细胞亚群（增殖(P) DP细胞和静止(Q) DP细胞）；结果与CyTOF的结果部分一致。有趣的是，CD3基因的表达水平在CD3+ DP细胞和CD3- DP细胞之间没有明显差异，表明这些未成熟的DP (P)细胞在CyTOF分析中与CD3- DP细胞相对应。
与正常胸腺相比，作者发现早期DP细胞在1型TETs中增加，而在2型TETs中减少，在3型TETs中几乎没有（图3c-e）。相比之下，成熟SP细胞的丰度在2型和3型TETs中显著增加（图3c-e）。此外，参与T细胞发育的T细胞亚群的组成在不同类型的TET中存在显著差异（图3c-e）。
为了进一步验证肿瘤中T细胞之间的发育差异，作者对之前定义的T细胞亚群进行了轨迹分析。与之前的研究结果一致，轨迹分析显示，与正常胸腺相比，不同类型TET的T细胞发育有明显差异（图3g）。通过组间分析，作者发现1型TETs中的T细胞在发育早期富集，而2型TETs中的T细胞在发育早期和晚期都富集（图3g）。Notch和Wnt信号元件的基因表达水平，调节T细胞发育的早期阶段，在从1型TETs分离的T细胞高于从2型和3型TETs分离的T细胞（图3h、i）。这些结果表明，在1型人TETs中，T细胞的发育过程在早期受到抑制，在2型人TETs中促进，而在3型人TETs中几乎消失。
图3.胸腺和TET亚型的T细胞发育障碍
Tips：上图可通过联川星云进行绘制
4、人类TETs中TCR序列的偏倚和TCR多样性
TCR库和TCR多样性与胸腺内T细胞发育密切相关。对于TCRβ，作者发现在TETs的肿瘤类型中VJ基因的使用存在明显的偏倚（图4a），这与DP和SP细胞的VJ基因使用模式相似。同样，VJ对T细胞在不同类型的TETs中也有显著差异（图4b），并且与DP和SP细胞一致。对于TCRα位点，如前所述，作者发现发育时间和V-J配对之间有明确的关联。在T细胞发育阶段，TCRα位点近端对的重组主要发生在DP期，远端对的重组主要发生在SP期。这种重组的偏倚反过来又限制了DP和SP细胞中TCRα的V-J配对。我们还观察到各肿瘤类型中VJ基因的使用和TCRα配对的模式分别与DP和SP细胞相似（图4c、d）。此外，作者发现肿瘤浸润T细胞的克隆型与scRNA-Seq定义的T细胞发育状态密切相关（图4e）。克隆型扩增主要在成熟SP细胞中观察到，而在未成熟DN和DP细胞中较少出现（图4e）。这也表明，未成熟T细胞（DN和DP细胞）的克隆多样性高于成熟T细胞（SP细胞），这与3型TETs中发现的低克隆多样性和高数量的SP细胞一致（图4f）。总之，这些发现揭示了人类TET类型之间的T发育差异对TCR序列和克隆扩增的潜在影响。
图4.TET亚型中VJ基因的使用、配对及TCR多样性
Tips：上图可通过联川星云进行绘制
5、上皮来源解码了人TET中T细胞发育障碍
为了进一步研究各种TET的上皮起源及其对T细胞发育的潜在影响，作者进一步分析了胸腺和肿瘤中上皮细胞（肿瘤细胞）的亚群（图5a）。在人TETs中观察到不同的上皮细胞组成。上皮细胞以3型TETs最多，1型和2型TETs较少（图5a）。基因表达分析显示，3型TETs中的上皮细胞表达了高水平的癌症干细胞（CSC）相关标志物（NOTCH2， CD24，ALDH1B1和PROM1）（图5a，b）。此外，轨迹分析显示，与3型TETs相比，1型和2型TETs的上皮细胞处于离散的发育阶段（图5d）。
为了进一步揭示TET亚型间肿瘤细胞的异质性，将TET中的上皮细胞重新聚集成17个细胞簇。通过基因表达分析，作者发现GNB3+ mTEC样细胞OVOL3、PLCB2、TRPM5表达量高，PLCG2、CHAT、DCLK1表达量低，这些都是正常胸腺簇状mTEC细胞的标记基因。同样，KRT14+ mtec样细胞表达高水平的CLU、FN1和IGFBP5，但不表达ITGA6、KRT17或SOX4。此外，作者发现CTSL和PRSS16主要在TETs中的ctec样细胞和mctec样细胞中表达。负责胸腺T细胞阴性选择的FEZF2和AIRE主要在CHI3L1+ mtec样细胞、MYOG+ tec样细胞、GNB3+ mtec样细胞和CHGA+ tec样细胞中表达。组间分析显示，不同TET亚型的肿瘤细胞亚群组成及TEC标记基因表达有显著差异。此外，该结果确定了每种TET的优势肿瘤细胞亚群（图5e）。免疫荧光进一步证实了每种TET类型的主要肿瘤细胞亚群（图5i）。有趣的是，在1型和2型肿瘤中存在的mctec样细胞比KRT14+ mtec样细胞和CCL25+ ctec样细胞表现出更多的胸腺上皮祖细胞（TEPCs）的分子特征。RNA速度分析表明KRT14+和GNB3+的mtec样细胞可能从mctec样细胞分化而来。通路分析发现NF-κB信号在1型TETs的mcTEC-like细胞中明显被激活，而在2型TETs中被抑制，揭示在1型TETs中促进了mcTEC-like细胞向KRT14+和GNB3+ mTEC-like细胞的分化，而在2型TETs中被抑制。此外，AIRE在2型TETs中的表达明显低于其他两种类型，这与自身免疫性疾病的发生有关。
但诱导血源性淋巴样祖细胞进入胸腺的关键趋化因子CXCL12和CCL25在CHI3L1+ mtec样细胞中几乎不表达。因此，作者重点研究了趋化因子介导的肿瘤细胞与淋巴细胞的相互作用，并证明TETs中的mtec类和mctec类肿瘤细胞可以通过CCL25:CCR9和CXCL12:CXCR3相互作用诱导DP细胞的正向选择迁移。此外，作者发现ctec样肿瘤细胞也通过CCL19:CCR7相互作用诱导SP细胞迁移，这与正常胸腺中的cTECs不同。
功能富集分析发现2型TETs DP细胞中高表达的基因在与T细胞扩增和正向选择相关的信号通路中显著富集，包括氧化磷酸化、NF-κB信号通路、th17、Th1和Th2细胞分化以及TNF信号通路。凋亡相关通路基因的高表达也表明2型TETs中更多的DP细胞发生了正选择。与正常胸腺组织相比，2型TETs的DP细胞高表达阳性选择相关信号通路的基因。此外，作者通过分析DP细胞正选择前或正选择进行状态的标记基因表达，发现1型TETs中的DP细胞主要表达与正选择进行状态相关的基因，而2型TETs中的DP细胞高表达与正选择进行状态相关的基因。这些结果表明，T细胞发育过程中的阳性选择在2型TETs中得到促进，而在1型TETs中被阻断，进一步证实了1型TETs肿瘤细胞中HLA-DR的表达水平低于其他类型TET。此外，作者将分类的肿瘤上皮细胞与1型和2型TETs的DP细胞进行了共培养实验，发现肿瘤细胞在体外可以直接促进T细胞的发育。综上所述，这些发现表明每种TET的特定上皮起源可能导致上皮-细胞- T细胞相互作用的独特功能障碍，从而导致T细胞发育障碍。
图5.三种TET肿瘤类型上皮细胞的异质性
Tips：上图可通过联川星云进行绘制
6、肿瘤细胞诱导CD8+ TRM细胞介导的3型TETs免疫应答
在三种类型的tet中，3型tet中几乎没有前体T细胞，而成熟T细胞仍然大量存在（图2c-g）。造成这一现象的可能原因是常见的恶性细胞诱导的免疫募集。作者证实CD8+ TRM细胞在外周组织的免疫监视网络中起着核心作用，在3型TETs中显著富集（图6a，b）。流式细胞术分析进一步证实了3型TETs中CD8+ TRM细胞独特的丰度。与其他上皮亚群相比，在3型TETs中高度富集的CHI3L1+ mtec样细胞被预测与CD8+ TRM细胞有更多的相互作用（图6c）。作者发现CHI3L1+ mtec样肿瘤细胞和CD8+ TRM细胞之间的特异性配体受体相互作用（图6d）。流式细胞术证实CXCR3在CD8+ TRM细胞上表达较高（图6e, f）。3型TETs中的CD8+ TRM细胞也表达了高水平的活化和增殖相关分子（图6g）。此外，与TETs中其他类型的T细胞相比，CD8+ TRM细胞中与激活相关的基因也显著上调（图6h）。在蛋白质水平上，CD8+ TRM细胞表达的活化相关分子水平高于其他T细胞亚群（图6i, j）。通路分析显示，CD8+ TRM细胞上调的基因在TCR信号通路、抗原处理和递呈、细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路中显著富集（图6k）。进一步分析表明，CD8+ TRM在3型TETs中可以通过多种趋化因子潜在地招募T细胞、B细胞、DC和巨噬细胞（图6l）。
图6.3型TETs中肿瘤驱动的CD8+ TRM细胞激活机制
Tips：上图可通过联川星云进行绘制
7、肿瘤细胞的分子标记与人TETs的存活有关
最后，作者建立一个基于肿瘤细胞上皮来源的人类TET分子分类系统。首先，作者根据scRNA-seq结果选择每种TET类型中独特上皮细胞类型的代表性基因（图5f），发现GNB3和CHI3L1分别在1型和3型TET的肿瘤细胞中高表达（图7a, b）。同样，通过IF染色进一步验证了肿瘤中GNB3和CHI3L1的表达（图7c）。因此，作者根据GNB3和CHI3L1的表达水平，将TCGA队列中的119例TET患者重新划分为三组。Kaplan-Meier生存分析显示，作者建立的分子分类与TET患者的生存密切相关（图7d）。而Masaoka分期和WHO分级的生存预测效果不显著。基于以上研究结果，作者提出了一个三方框架来解释肿瘤细胞的起源及其对人类TETs肿瘤微环境中T细胞发育的影响（图7e）。
图7.利用肿瘤细胞代表性基因标记对TETs进行重新分类
Tips：上图可通过联川星云进行绘制
精彩公告
联川单细胞服务继续升级，实现流式细胞仪与单细胞平台的完美搭配！
联川开启一站式流式分选+单细胞测序业务！
如果您在联川开展单细胞项目，并且您的样本前期需要进行细胞分选实验，那么请您选择联川！
联川目前已经配备以下抗体，且实现完备的分选流程：
Human T cells：
Anti-Human CD3,FITC;
Anti-Human CD4,APC;
Anti-Human CD8a,PE
Human B cells：
Anti-Human CD19,APC
Human immune cells：
Anti-Human CD45,FITC
我们将解锁更多细胞类型的分选实验，敬请期待！
杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。单细胞测序作为联川战略发展方向，在组织解离和单细胞生信分析方面充分发挥自身优势，为客户提供优质的服务。目前已经与100多个国家及地区的科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞测序相关的SCI论文近百篇，影响因子平均15+。
所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由